Испытание препарата «Полиаписоген» при эксперементальном эшерихиозе

Действенным оружием антиинфекционной защиты организма животных и человека является иммунотерапия с использованием лечебнопрофилактических сывороток и глобулинов, в частности, противоколибактериозной антитоксической сыворотки при эшерихиозе. Однако, несмотря на определенную эффективность применения указанной сыворотки, нередко она теряет свою, поскольку, в настоящее время многие инфекционные болезни, в том числе и эшерихиозы, протекают в виде осложнений, обусловленных воздействием на организм сочетанного действия антропогенных факторов физической, химической и биологической природы. Поэтому применение на этом фоне регламентированных при конкретной инфекции средств не достигает цели, что диктует необходимость усовершенствования существующих и разработку более эффективных лечебно-профилактических средств.

Основываясь на принципе К. Ландштейнера (1946) о возможности получения конъюгированных антигенов на основе низкомолекулярных химических соединений и белковых носителей, нами был сконструирован комплексный (белково-кадмиевый радиоантиген - БКРА) антиген, который индуцировал в организме экспериментальных животных синтез факторов антиэшерихиозной, антикадмиевой и антирадиационной защиты. На основе поликлональных антител (полиглобулинов), продуктов пчеловодства (Вита-Форце), продуктов метаболизма B.subtilis, B.bifidum и микрочастиц природного минерала-монтмориллонита      нами      был      сконструирован полифункциональный композиционный лечебно-профилактический препарат «Полиаписоген», обладающий широким спектром биологического действия.

Учитывая многокопонентность препарата и вероятность наличия в его составе антиинфекционного, антитоксичного и антирадиационного факторов, проводили настоящие исследования, целью которых является испытание лечебной антиинфекционной активности препарата при экспериментальном эшерихиозе.

Материалы и методы. Для моделирования эшерихиозной инфекции в качестве тест-микроба использовали вирулентный (энтеропатогенный) штамм возбудителя эшерихиоза поросят Е. coli «KB-1», продуцирующий адгезивный антиген К-99, который вводили внутрибрюшинно в дозе 2x10⁶ м.к./мышь. В опытах использовали 120 белых мышей обоего пола, живой массой 17-20 г, разделенных на 6 групп по 20 животных в каждой. Животным 1-й группы, за 24 ч до заражения возбудителем эшерихиоза, однократно подкожно вводили инъекционную форму препарата «Полиаписоген» в дозе 25 мг/кг по сухому веществу; животным 2-й группы - в тех же дозах и идентичных условиях препарат вводили через 24 ч после заражения; животным 3-й группы за 24 ч до заражения вводили антиэшерихиозную сыворотку и внутримышечно хлорамфеникол в дозе 20-35 мг 2-3 раза в день в течение 5-7 дней подряд; животным 4-й группы указанные препараты в тех же дозах вводили через 24 ч после заражения; зараженным животным 5-й группы никакие препараты на вводили и они служили контролем заражения; животных 6-й группы не заражали и никакие препараты им не вводили - они служили биологическим контролем

Развитие эшерихиозного инфекционного процесса в зараженном организме и его модификации под воздействием испытуемого композиционного препарата «Полиаписоген» контролировали по клиникогематологическим, иммунологическим, микробиологическим и патоанатомическим показателям. Подтверждением диагноза на эшерихиоз являлось развитие лейкопении и гранулоцитопении в периферической крови, уменьшение содержания глобулинов в сыворотке крови, нарушение иммунорегуляторного индекса (ИИ) - дисбаланс Т-хелперного и Т-супрессорного соотношения субпопуляций лимфоцитов (Th/Ts), развитие постинфекционного антителогенеза и лейкопении, микробная обсеменность органов и тканей.

Результаты исследований и обсуждение. Динамическое наблюдение за животными и гематоксические, иммунологические и микробиологические исследования показали, что однократное подкожное введение препарата «Полиаписоген» оказывало модифицирующее действие как на течение эшерихиозной инфекции, так и на указанные показатели инфекционного процесса. В таблице 1 представлены результаты изучения показателей периферической крови зараженных возбудителем эшерихиоза и на леченых испытуемым препаратом белых мышей через- 3 дня после заражения и лечения животных.

• 1.    Влияние препарата «Полиаписоген» на показатели периферической крови пораженных возбудителем эшерихиоза белых мышей (на 3-и сут после заражения)

  Группы животных	Эритроциты, 1012/л	Лейкоциты, 10%	Нейтрофилы, 109/л	Лимфоциты, 109/л	Моноциты, %
  Контрольная	8,5±0,3	2,9±0,2	0,9±0,0;	1,8±0,2	1,1 ±0,3
  Зараженная Е. coli «KB-1»	8,1±0,5	1,03±0,Г	о,2±о,о;	0,7±0,З*	0,6±0,01*
  Зараженная и леченная препаратом «Полиаписоген»	8,3±0,1	2,7±0,09	0,7±0,0	1,6±0,07	0,9±0,07

• 2.    Состояние клеточного и гуморального иммунитета у зараженных возбудителем эшерихиоза и леченных препаратом «Полиаписоген» белых мышей (на 3-й сут после заражения)

• 3.    Содержание E. coli и Enterobacter в тонком отделе кишечника зараженных возбудителем эшерихиоза и леченных препаратом «Полиаписоген» белых мышей (КОЕ/г, lg)

• 4.    Концентрация медиаторов воспаления в сыворотке крови и супернатантах лимфоцитов пораженных возбудителем эшерихиоза и леченных препаратом «Полиаписоген» белых мышей через 3 сут после заражения и лечения

  Показатель	Контроль	Зараженные E.coli	Зараженные E.coli и леченные препаратом «Полиаписоген»
  ИЛ-1 в сыворотке крови, нг/мл.	9,3±1,1	13,5±1,7	10,1±1,5
  ТНФ-а в сыворотке крови, нг/мл	2,9±0,3	5,1 ±0,9х	3,0±0,7
  ИФН-у в супернатанте лимфоцитов, ед/мл	17,7±2,1	25,5±1,9Х	18,1±2,3

  Из данных таблицы видно, что однократное подкожное введение многокомпонентного композиционного препарата «Полиаписоген» зараженным возбудителем эшерихиоза белым мышам снижает уровень циркулирующих в крови провоспалительных гормонов (ИЛ-1, ТНФ- а и ИНФ- у) до контрольных значений. В основе противовоспалительного действия композиционного препарата «Полиаписоген» на макрофаги, по-видимому, лежит подавление активности фактора транскрипции (Matsumori A. et. al., 2000). В итоге препарат уменьшает уровень экспрессии цитокиновых и информационных и-РНК, что обуславливает снижение концентрации противовосполительных цитокинов ИЛ-1, ТНФ- а и ИНФ- у.

Из данных таблицы видно, что однократное подкожное введение инъекционной формы препарата «Полиаписоген» зараженным возбудителем эшерихиоза белым мышам через 24 ч после заражения, оказывало гемопротективный эффект, препятствуя постинфекционной лейкопении, нейтропении и лимфопении.

Учитывая, что гемопротективное действие иммунотропных препаратов реализуется через систему иммунитета посредством гуморальных (иммуноглобулины, медиаторы иммунитета - цитокины) и клеточных (Т- и В-лимфоциты, макрофаги) компонентов (Anderson R.E. 1983), нами были проведены параллельные исследования по изучению состояния клеточного и гуморального иммунитета у зараженных возбудителем эшерихиоза и леченных испытуемым препаратом белых мышей.

Результаты исследований показали (табл.2), что развитие эшерихиозного инфекционного процесса в организме сопровождалось значительными изменениям системы клеточного и гуморального иммунитета: к моменту гибели белых мышей от эшерихиозной интоксикации последовало почти двукратное (в 1,96 раза, Р<0,05) снижение содержания В-лимфоцитов при одновременном увеличении (в 1,16 раза, Р>0,05) количества Т-лимфоцитов. Увеличение содержания Т-лимфоцитов происходило за счет увеличения Т-хелперов при одновременном уменьшении содержания Т-супрессоров (в 1,12 раза, Р>0,05).

Указанный дисбаланс (разнонаправленность) субпопуляционного состава Т-клеток под воздействием инфекционного агента является важнейшим показателем функционирования клеточного звена иммунитета и характеризуется как хелперно-супрессорное соотношение (Th/Ts). Как видно из данных таблицы 2, развитие эшерихиозной инфекции у белых мышей сопровождалось существенным нарушением иммунорегуляторного индекса в сторону увеличения этого показателя (Th/Ts=3,05).

Показатель	Группы животных
	контрольная	зараженная Е. соli «КВ-1»	леченная «Полиаписоге
В-лимфоциты, %	22,9±0,7	11,7±0,5*	19,5±0,3
Т-лимфоциты, %	42,7±1,9	49,5±1,1	41,9±2,1
Т-хелперы, %	29,3±1,3	31,5±1,9	28,7±1,5
Т-супрессоры, %	11,5±1,5	10,3±1,7	10,7±1,8
Соотношение T h /T s	2,54	3,05	2,68
Иммуноглобулины класса G	25,3±1,3	14,7±2,5*	23,9±1,1
Бласттрансформирующая активность лимфоцитов (РБТЛ,%)	54,7±3,9	27,3±1,7*	50,5±2,7

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов.

Несмотря на то, что увеличение Т-хелперов при одновременном уменьшении Т-супрессоров должно было бы свидетельствовать о положительной иммунобиологической перестройке организма, однако у пораженных возбудителем эшерихиоза животных увеличение субпопуляционного индекса не приводило к усилению синтеза иммуноглобулинов, а наоборот, последовало резкое (в 1,72 раза, Р<0,05) снижение содержания иммуноглобулинов (IgG) и бласттрансформирующей активности лимфоцитов. Неспособность синтеза В-клетками IgG ассоциируется иммунопатологией с активацией Lg-1, Qa-1+-хелперных и Lg-123+, Qa-1+-регуляторных Т-клеток, которые сдерживают синтез иммуноглобулинов. Как известно, для этого необходима активация Т-хелперов типа Lg-1 Qa-1+ и Lg-1 Qa-1- (Cantor H. 1980). Следовательно, увеличение субпопуляционного индекса (Th/Ts) при эшерихиозе свидетельствует о развитии в пораженном организме иммунотоксического (аллергического) процесса, обусловленного накоплением в организме токсических продуктов метаболизма Е. coli: экзо- и эндотоксинов, обладающих сенсибилизирующими свойствами.

Однократное подкожное применение испытуемого препарата оказывало иммунорегуляторное действие на клеточный и гуморальный иммунитет, обеспечивая нормализацию иммунорегуляторного индекса с восстановлением функциональной активности В-лимфоцитов, обеспечивающих синтез IgG на фоне восстановления их бласттрансформирующей активности (РБТЛ).

Развитие септической формы эндотоксемии у пораженных возбудителем эшерихиоза животных сопровождалось не только нарастанием обсеменения тонкого кишечника Е. coli, но и транслокацией патогенного агента из кишечника во внутренние органы, обусловливая бактериемию. Результаты анализа особенностей развития эшерихиозной инфекции у животных и лечения испытуемым препаратом представлены в таблице 3, в которой, с целью ограничения цифрового материала, приведены только данные исследования на 3-й сут после заражения и лечения испытуемым препаратом.

Группа Е. coli Enterobacter частота высевов, % содержание на грамм ткани, lg) частота высевов, % содержание на грамм ткани, lg) Контрольная 7,3 0,13±0,02 1Д2 0,07±0,001 Зараженная Е. coli 100,0* 5,33±0,09* 100,0* 4,98±0Д5* Зараженная Е. coli и леченная препаратом «Полиаписоген» 21,1 1,39±0,31 17,13 1,03±0,05 х-Р<0,05

Из данных таблицы видно, что однократная подкожная инъекция испытуемого средства уже на 3-й сутки обеспечивала существенное снижение частоты высевов кишечной палочки и энтеробактера из проб тонкой и подвздошной кишок, а также достоверное снижение концентрации микробов на грамм ткани, предотвращая колонизацию тонкого отдела кишечника условно-патогенными грамотрицательными микробами.

Результаты параллельных серологических исследований проб органов и тканей на наличие специфического антигена (К 99) и энтеротоксина E.coli показали, что обсеменение тонкого кишечника периферической крови и внутренних органов сопровождалось антигенемией и эндотоксинемией. Применение препарата «Полиаписоген» в качестве средства ранней (превентивной) терапии сепсиса при эшерихиозном инфекционном процессе оказывало биоцидное действие на возбудителя, снижая концентрацию клеток Е. coli, уровень антигенемии и энтеротоксинемии.

Нарастание обсеменения тонкой кишки микробами семейства Enterobacteriaceae при поражении организма эшерихиями приводит к повышению уровня бактериальных эндотоксинов и антигенов в системном кровотоке. Резидентные тканевые макрофаги и клетки Купфера являются основным барьером на пути бактериальных эндотоксинов и антигенов, поступающих в портальный кровоток из правого синуса. При этом в макрофагах активируется ядерной фактор транскрипции NФ-карра В, что приводит к усилению экспрессии генов и усилению биосинтеза воспалительных цитокинов (Yanagawa H., 1993). Следовательно, в первые сутки после заражения возбудителем эшерихиоза возникает повышенная нагрузка на макрофаги, которая трансформируется в усиление воспалительной активности макрофагов с возрастанием синтеза и продукции медиаторов воспаления, ключевыми из которых являются синергически действующие цитокины:  интерлейкин- 1 (ИЛ- 1), туморнекротический фактор

(ТНФ-α) и γ-интерферон (ИНФ- γ). Чрезмерное накопление медиаторов воспаления вызывает развитие септического шока, нарушение тканевой перфузии и наступление летальных исходов (Будагов Р.С. 2004).

С учетом изложенного нами были проведены биохимические исследования по изучению влияния испытуемого препарата на воспалительный цитокинез у зараженных возбудителем эшерихиоза белых мышей, результаты которых представлены в таблице 4.

Учитывая, что поражение животных эшерихиозной инфекцией сопровождалось антигенемией, энтеротоксинемией и бактериемией, обуславливая септический воспалительный процесс, при котором тканевым и циркулирующим макрофагам и микрофагам принадлежит ведущая роль в противоинфекционной защите, нами были проведены опыты по изучению влияния испытуемого препарата на показатели неспецифической резистентности организма.

Результаты проведенных исследований в этом направлении показали, что применение изучаемого лечебного средства препятствовало снижению факторов неспецифической резистентности - значения исследованных показателей недостоверно отличались от таковых биологического контроля, уступая не более, чем в 1,04 - 1,14 раза (Р>0,03).

Заключение . Однократное подкожное введение препарата «Полиаписоген» белым мышам как до (за 24 ч), так и после (через 24 ч) заражения оказывало модифицирующее действие на течение и исход эшерихиозной инфекции, обеспечивая выживаемость 75-80% летально зараженных животных. Механизм антиэшерихиозного биозащитного эффекта препарата реализовался путем регулирования воспалительного потенциала макрофагов с ингибированием синтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ТНФ- а и ИНФ- у), снижения антигенной нагрузки на организм, детоксикации бактериальных эндотоксинов, снижения бактериальной обсеменности органов, блокирования транслокации Е. соН из кишечника во внутренние органы, усиления факторов специфической (восстановление уровня синтеза иммуноглобулинов, иммунорегуляторного индекса - Th/Ts) и неспецифической (бактерицидной, лизоцимной активности сыворотки, функциональной активности макро- и микрофагов) резистентности организма, что приводит к повышению выживаемости зараженных возбудителем эшерихиоза животных.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Будагов, Р.С. Влияние средств микробного происхождения на содержание цитокинов в сыворотке крови и выживаемость мышей при комбинированных радиационных поражениях / Р.С. Будагов, Л.П. Ульянова// Радиац. биол. Радиоэкол. -2004. -Т.41. - №41. - №1. - С.38-42. 2. Anderson, R.E. The made of action of thymic hormones and its relevance to T- cell differenation/ R.F. Anderson, J.C. Standefec// J. Immunol. - 1983. - V.I 17. - P.381-387. 3. Cantor, H. T-cell sets: the role of thies genetic programme in immunoregulation/ H. Cantor, R.K. Gershon// Immune Syst. - London. - 1988. - P.13-25. 4. Landsteiner, K. The specificity of serologic reactions. - Camfricide: Harvard Univ. press. -1946.-326 p. 5. Matsumori, A. Nifedrine inhibits activation of transcription factor NF-kappa B / A. Matsumori, Y. Nunokawa, S. Sasagava// Life Sci. -2000. - V.67. - P.2655-2661. 6. Yanagawa, H. Abnormal levels of proimflammatory cytokines in serum and monocyte cultures// Hematol. Oncol. - 1993. - №3. - P.143-154.

ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТА «ПОЛИАПИСОГЕН» ПРИ ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНОМ ЭШЕРИХИОЗЕ

Гайзатуллин Р.Р.

Резюме

Описано развитие эшерихиозного инфекционного процесса в зараженном организме и его модификации под воздействием композиционного препарата «Полиаписоген».

THE TEST DRUG «POLIAPISOGEN» IN THE EXPERIMENTAL ESHERIHIOZE

Gaizatullin R.R.