Исследование аллельных вариантов генов VDR и PAI у пациентов с асептическим некрозом головки бедренной кости

АНГБК – тяжёлое дегенеративно-дистрофическое заболевание, являющееся следствием нарушения структуры костной ткани, микроциркуляции и жировой дистрофии костного мозга [1–3]. Указанные факторы влияют на стрессовое ремоделирование кости. В зависимости от этиологии АНГБК подразделяют на первичный (идиопатический) и вторичный. Вторичный АНГБК диагностируется в случаях, когда прямое нарушение микроциркуляции кости или костного мозга связано с идентифицируемой причиной, такой как травматические повреждения, приём стероидов или бисфосфонатов, избыточное потребление алкоголя, серповидно-клеточная анемия, аутоиммунные заболевания, химиотерапия или злокачественные новообразова- ния [4–6]. Первичные или идиопатические проявления АНГБК диагностируются в ситуациях, когда причины развития патологии изучены не полностью. В медицинской литературе как потенциальные причины развития идиопатических форм АНГБК описаны генетически детерминированная чувствительность органов и тканей к кальцитриолу, а также наследственная тромбофилия и гипофибринолиз [7–9]. Кальцитриол – физиологически активный конечный метаболит витамина D, образующегося в коже под действием ультрафиолета (холекаль-циферол) и поступающего с пищей (эргокальциферол). Минеральный обмен организма зависит не только от содержания кальцитриола, но и чувствительности к нему органов-мишеней [10]. Экспрессируемый геном локуса

рецептора витамина D (VDR) внутриклеточный рецептор кальцитриола на финальном этапе D-витаминного обмена определяет чувствительность органов и тканей к кальцитриолу [11]. Поскольку АНГБК является муль-тифакториальным заболеванием, аллельные варианты гена VDR могут выступать в качестве фактора риска [12– 14]. В патогенезе асептического некроза также описаны генные мутации белков системы коагуляции и фибринолиза. Одним из основных компонентов тромболитической плазминоген-плазминовой системы фибринолиза является ингибитор тканевого активатора плазминогена типа 1 (PAI-1) [15]. В ряде работ было показано, что гомозиготный вариант 4G/4G гена ингибитора активатора плазминогена -675 5G > 4G (rs1799889) PAI-1 связан с повышенным риском асептического некроза головки бедренной кости [16–18].

Исходя из вышеизложенного, изучение полиморфизмов генов, определяющих чувствительность органов и тканей к кальцитриолу, а также причастных к наследственной тромбофилии и гипофибринолизу, как молекулярно-генетических маркеров развития АНГБК, представляется актуальным.

Цель данной работы состояла в оценке информативности использования аллельных вариантов генов, определяющих чувствительность органов и тканей к каль-цитриолу ( VDR ), а также причастных к наследственной тромбофилии и гипофибринолизу ( PAI-1 ), в качестве молекулярно-генетических маркеров развития АНГБК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведен сравнительный анализ частоты встречаемости значимых аллельных вариантов A-3731G (Cdx2) и +283 G > A (BsmI) гена рецептора витамина D VDR и -675 5G > 4G (rs1799889) гена ингибитора активатора плазминогена PAI-1 у пациентов с верифицированным диагнозом АНГБК (основная группа) по сравнению с общепопуляционным контролем, включающим опубликованные данные практически здоровых лиц русской национальности обоих полов.

Было обследовано 300 больных (168 женщин и 132 мужчины) с асептическим некрозом головки бедренной кости. Все обследованные добровольно обратились за специализированной медицинской помощью в клинику по лечению асептического некроза головки бедренной кости (ООО "Медицинский центр ХуанДи"). Средний возраст составил для мужчин – 56,5 ± 0,1 года, для женщин – 59,1 ± 0,1 года. Группа обследованных лиц являлась этногенетически однородной и включала русских, проживающих в европейской части Российской Федерации.

В данную группу вошли пациенты, у которых диагноз АНГБК устанавливали по результатам объективного осмотра, анализа инструментальных и лабораторных исследований, а также анализа анамнестических данных (диспластические изменения суставов, наличие физических перегрузок, стрессов, травм, низкоэнергетических переломов у пациента или у родителей, избыточное потребление алкоголя, курение, проведение терапии глюкокортикоидами, наличие системных заболеваний, болезней крови, неусваиваемость молока; у женщин учитывали продолжительность периода постменопаузы; у мужчин отмечались проблемы, связанные с пониженным уровнем тестостерона).

Исследования тазобедренных суставов проводили методами компьютерной и магнитно-резонансной томографии, а также рентгенографии в 3-х проекциях: на спине, на животе, с отведением по Лаунштейну. Стадия АНГБК устанавливалась в соответствии с критериями классификаций Ficat и ARCO. Для оценки функциональной состоятельности суставов использовали анке- ту Harris Hip score. С помощью ультразвуковой денситометрии на аппарате "Sunlight MiniOmni" (BeamMed. LTD, Израиль) оценивали минеральную плотность и качество костной ткани проксимальной фаланги 3-го пальца недоминантной руки и лучевой кости.

На автоматизированной станции KingFisher Flex (Thermo Scíentífíc) осуществляли экстракцию геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови пациентов. Определение однонуклеотидных полиморфизмов генов VDR и PAI-1 проводили методами ПЦР и пиросеквенирования с использованием амплификатора «Eppendorf MasterCycler Nexus Gradient» (Германия) и оборудования с программным обеспечением Pyro Mark Q24 QIAGEN (Германия) на базе коммерческой диагностической лаборатории. При постановке ПЦР использовали полимеразу и буферный раствор производства ООО «Лаборатория Изоген»; аллель-спец-ифические олигонуклеотиды – ЗАО «Евроген». Для сравнения исследованных показателей использовались опубликованные значения, полученные при проведении общепопуляционных исследований русских в европейской части Российской Федерации [11, 19, 20].

Статистическая обработка полученных данных включала проверку на соответствие выборок обследованных лиц и контрольной выборки равновесию Харди-Вайнберга, сопоставление частот исследуемых полиморфизмов в основной и контрольной группах. Достоверность различий определялась на основании точного критерия Фишера (F-критерий) и критерия χ2 Пирсона с использованием программного пакета WinPepi . Ассоциации между заболеванием и генотипом определялись на основе мультипликативной и аддитивной моделей наследования. Расчет коэффициентов соотношения шансов [21] (odds ratio – OR) с 95 % доверительным интервалом (95 % CI) проводили при выявлении значимых различий показателей больных АНГБК и популяционного контроля с использованием программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях случай – контроль» .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованным локусам в контрольных выборках и группах больных соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди–Вайнберга (p > 0,05), за исключением двух случаев: rs11568820 (контроль) –

P = 0,017; rs1544410 – P = 0,052. Данное обстоятельство учитывали при проведении статистической обработки.

Ген рецептора витамина D VDR человека локализован на хромосоме 12q12-q14. В гене VDR обнаружено около 30 однонуклеотидных полиморфизмов, которые можно идентифицировать с помощью соответствующих рестрикционных эндонуклеазных ферментов. Наиболее известны из них ApaI (rs7975232), BsmI (rs1544410), FokI (rs2228570), TaqI (rs731236) и Cdx2 (rs11568820) [22, 23]. Полиморфизм A -3731G (Cdx2) (rs 11568820) расположен в 5'-промоторной области гена VDR. У носителей аллели G (Cdx2) VDR транскрипционная активность гена снижена до 70 % от уровня носителей аллели А. В работах по изучению данного полиморфизма также было отмечено, что наличие мутантной аллели A обеспечивает устойчивость носителя к потере минеральной плотности костной ткани в условиях сниженного потребления кальция [19, 24]. Полиморфизм BsmI локализован в 3'-регуляторной области, участвует в регуляции стабильности мРНК. Генотип AA ассоциирован с повышенным риском развития остеопороза у женщин в постменопаузе и ответом на антирезорбтивную терапию [25, 26], а также увеличением риска перелома бедра по сравнению с генотипом GG [27].

Анализ полученных данных (табл. 1) показал, что у больных АНГБК частоты носителей генотипов GG, AG и AA полиморфного локуса A-3731G (Cdx2) гена VDR (rs11568820) достоверно отличались от популяционных данных контроля: 71,0, 26,0, 3,0 % и 44,8, 48,8 и 6,4 % соответственно ( χ ² = 35,26; df [0, 1, 2], 1, P = 3,0 E-9). При носительстве генотипа G/G локуса A-3731G (Cdx2) гена VDR вероятность формирования АНГБК возрастает в 3 раза (OR = 3,02: CI 2,12–4,29). В группе лиц с диагнозом АНГБК процент носителей G аллели составил 84 % и статистически значимо превышал таковое значение контрольной группы (69,2 %) (F = 0,000041, ξ ² =17,01). Носительство аллели G ассоциируется с повышенной в 2,3 раза вероятностью развития асептического некроза головки бедренной кости (OR = 2,34, CI 1,55–3,52).

Статистически значимых различий частот аллелей в полиморфном локусе +283 A > G (BsmI) гена VDR в группе лиц с патологией и контрольной группе не обнаружено (табл. 1). В данном локусе имеет место незначительное нарушение равновесия Харди-Вайнберга (P = 0,052). Установлено, что частоты генотипов данного локуса в группе больных АНГБК и лиц из популя- ционной выборки достоверно отличаются: 51,0, 41,7, 7,3 % и 43,3, 38,3, 18,4 % соответственно (χ2 = 3,85; df [0, 1, 2], 1, P = 0,05) (табл. 1); риск развития патологии повышен при носительстве генотипа A/A гена VDR (OR = 2,36; 95 % CI:1,03–5,42).

Ген PAI-1 кодирует один из основных ингибиторов фибринолиза – ингибитор активатора плазминогена 1-го типа ( PAI-1 ). Ген PAI-1 расположен в хромосоме 7q21.3-22 человека [28, 29]. Основной полиморфизм PAI-1 представляет собой одиночную вставку/деле-цию гуанина (G) в положении 675 в промоторной области PAI-1 и может вызывать изменения скорости транскрипции гена. Этот полиморфизм включает две аллели, которые содержат четыре или пять последовательных гуаниновых оснований (4G и 5G). Лица, гомозиготные по аллели 4G (4G/4G), имеют более высокие уровни транскрипции генов и более высокую плазменную концентрацию PAI-1 , по сравнению с гомозиготами по аллели 5G (5G/5G) и поэтому, возможно, имеют повышенный риск внутрисосудистого тромбоза. У гетерозигот (4G/5G) уровни содержания PAI-1 в плазме промежуточные. Аллель 4G обладает более высокой транскрипционной активностью (продуцирует до шести раз больше мРНК), чем 5G, и характеризуется повышенной экспрессией PAI-1 . Повышение концентрации PAI-1 в плазме приводит к увеличению тромбозов. Результаты ряда мета-анализов [30, 31] показали, что полиморфизм PAI-1 -675 4G > 5G (rs1799889) может быть связан с риском развития АНГБК.

Анализ приведенных в таблице 2 данных показал, что носительство аллели 5G полиморфного локуса PAI-1 -675 4G > 5G (rs1799889) у больных АНГБК выявляется чаще, чем у лиц из популяционной выборки: 50,0 % против 41,95 % (OR = 1,39; 95 % CI:1,04–1,85). Следует отметить, что генотипические частоты данного полиморфного локуса в популяционной выборке и группе больных АНГБК достоверно отличаются: 51,0, 41,7, 7,3 % и 43,3, 38,3, 18,4 % соответственно ( χ ² = 4,64; df [0, 1, 2], 1, P = 0,03) (табл. 2); риск развития патологии повышен в 2 раза при носительстве генотипа 5G/5G в данном локусе гена PAI-1 (OR = 1,98; 95 % CI:1,22–3,20).

Таблица 1

Частота аллелей и генотипов полиморфных локусов гена VDR у больных АНГБК и здоровых индивидов