Исследование бактериостатических свойств хлорсодержащего препарата для свеклосахарного производства

Для повышения сохранности сахарной свеклы, роста хозяйственной и экономической эффективности ее переработки большое внимание уделяется разработке новых способов обработки свекловичной стружки с применением бактерицидных препаратов широкого спектра действия.

Нами был изучен хлорсодержащий препарат, обладающий фунгицидными, вируле-цидными и спороцидными свойствами [1].

Целью работы явилось исследование бактериостатического действия хлорсодержащего препарата, т.к. конкретные данные о его влиянии на рост микроорганизмов отсутствуют. Для достижения поставленной цели проводили ряд экспериментов, связанных с культивированием микроорганизмов на среде, содержащей исследуемый препарат.

Объектом исследования служила чистая культура бактерий Leuconostoc mesenteroides штамм В-4177, полученная из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва). Физиологически активную культуру L. mesenteroides вносили в свежую селективную питательную среду, рекомендованную ВКПМ, инкубировали в термостате при 37 ° С в анаэробных условиях в течение 5 суток. Хлорсодержащий препарат вносили в питательную среду (MRS (г/дм³): Бактопептон – 10,0; мясной экстракт – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; глюкоза – 20,0; твин 80 – 1,0; аммоний лимоннокислый – 2,0; натрий уксуснокислый – 5,0; MgSO 4 x7H 2 O – 0,1; MnSO 4 x5H 2 O – 0,05; Na 2 HPO 4 – 2,0; агар – 20,0) в количестве 2 см³ при рН 6,5 и температуре 30 ⁰С. В качестве контроля использовали питательную среду без добавления препарата [1].

Накопление биомассы Leuconostoc mes-enteroides контролировали нефелометрическим методом путем измерения оптической плотности питательной среды на разных этапах процесса культивирования. Рабочая длина волны была выбрана в соответствии с положениями, что для измерения светорассеяния выбирается светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной суспензии. В нашем случае рабочая длина волны – 560 нм [3]. Данный метод основан на том, что микроорганизмы в большинстве случаев не окрашены и почти прозрачны, поэтому суспензия клеток поглощает свет в видимой области спектра незначительно. Уменьшение интенсивности света после прохождения через суспензию связано, главным образом, с его рассеянием. В определенных пределах количество света, рассеивае- 188

мого суспензией микроорганизмов, пропорционально содержанию клеток [2].

Количественный анализ накопления биомассы бактерий проводили на фиксированных мазках по методу Виноградского-Шульгиной-Брида [4]. Метод предназначен для определения численности микроорганизмов в различных естественных субстратах. Отбор суспензии был произведен по истечение 24 ч – время, когда было достигнуто максимальное количество клеток в питательной среде. Для подсчета клеток брали строго определенное количество исследуемой суспензии, наносили микропипеткой на хорошо обезжиренное сухое предметное стекло. К капле суспензии добавляли стерильный водный раствор агар-агара с массовой долей 0,03 %, быстро перемешивали стерильной бактериологической петлей и равномерно распределяли по отмеченной на бумаге площади. Мазок высушивали на воздухе, фиксировали 20-30 мин 96 % спиртовым раствором и окрашивали красителем в течение определенного времени. За- тем препарат осторожно промывали в кристаллизаторе водой. Подсчет клеток микроорганизмов проводили с иммерсионным объективом и рассчитывали по формуле [3]:

x ■ 4 - 10 8 ■ K 0,05 ■ S

где х - число клеток в поле зрения; К – степень разведения суспензии; S - площадь поля зрения, S = 0,02мм²; 0,05 - объем суспензии, см³;

4 - 10 8 - площадь мазка, мкм².

Еще одним параметром, косвенно характеризующим накопление биомассы, является активная кислотность суспензии, которую определяли по изменению рН среды через каждые 6 ч культивирования. Как известно, по изменению рН среды можно контролировать интенсивность метаболических процессов микроорганизмов, что служит показателем трансформации сахаров в органические кислоты как конечные продукты метаболизма. В частности, Leuconostoc mesenteroides для синтеза декстрана выделяет ферменты, расщепляющие сахарозу.

При изучении динамики роста и кисло-тообразования бактериальной культуры исследуемые показатели определяли в динамике через каждые 6 ч в течение 5 суток роста. Результаты эксперимента приведены графически на рисунках 1, 2.

с     опт

;     контроль продолжительность процесса, ч

Рисунок 1. Динамика оптической плотности суспензии микроорганизмов

^^^^^^опт г    контроль

Продолжительность процесса,ч

Рисунок 2. Динамика рН среды при культивировании Leuconostoc mesenteroides

Анализ полученных результатов показал, что изменение оптической плотности в опыте с введением хлорсодержащего препарата во времени протекает с меньшей скоростью по сравнению с контролем. Так, к 24 ч культивирования бактерий уровень оптической плотности среды в контроле был в 1,8 раза выше по сравнению с опытом. Так же способность бактериальной культуры к кислотообразованию при отсутствии препарата в среде значительно выше. Это свидетельствует о снижении скорости роста и физиологических возможностей бактериальной культуры, выращенной с добавлением хлорсодержащего препарата.

Полученные данные хорошо коррелируют с численностью бактериальных клеток в опытном и контрольном вариантах. Так, в кон- трольном образце содержание клеток составило 1,7⋅1016, в опыте с введением хлорсодержащего препарата в среду культивирования это значение на два порядка ниже 5,8⋅1014. На рисунке 3 (а, б) представлены фотографии контрольного и опытного образцов соответственно.

а)

б)

Рисунок 3. Интенсивность роста бактерий Leuco-nostoc mesenteroides: а – контроль, б – опыт (с введением хлорсодержащего препарата)

Исходя из результатов эксперимента можно сделать вывод, что хлорсодержащий препарат обладает бактериостатическим действием в отношении грамположительных сапрофитных кокков Leuconostoc mesenteroides и может быть рекомендован к использованию в условиях свеклосахарного производства.

Вестник ВГУИТ, №4, 2014