Исследование биотехнологического потенциала микробного консорциума

Курунга и кумыс – национальные кисломолочные продукты гетероферментативного брожения, издавна используемые в сочетании с антибиотиками для предупреждения и лечения различных форм туберкулеза, желудочно-кишечных и сердечно-сосудистых заболеваний, при авитаминозе и нарушениях обмена веществ, при заболеваниях нервной системы и общем упадке сил. Лечебные свойства этих продуктов обусловлены их микробиологическим составом. Микрофлора этих напитков содержит термофильные и мезофильные лактобактерии, ацетобактерии, дрожжи, сбраживающие и не сбраживающие лактозу [9, 10, 11, 14].

Проблеме создания микробного консорциума курунги и кумыса посвящен ряд отечественных и зарубежных исследований. Обзор современных технологий гетероферментатив-ных кисломолочных продуктов показал, что для получения стартовых культур в основном используются чистые культуры лактобактерий и дрожжей [7, 12].

Известные современные технологии производства курунговых и кумысных заквасок на чистых культурах не нашли широкого промышленного внедрения. В таких заквасках при всей тщательности подбора штаммов дрожжей и лактобактерий не удается составить симбиоз, характерный для естественной популяции микроорганизмов этих продуктов. Поэтому применение заквасок на чистых культурах в промышленном производстве не гарантирует получение продукта со стабильными показателями.

Единственным кисломолочным продуктом гетероферментативного брожения, производимый в промышленном масштабе на естественной закваске, является кефир.

Известно, что микрофлора кефира представляет естественный симбиоз различных видов дрожжей, сбраживающих и не сбраживающих лактозу, термофильных и мезофильных лактобактерий, ацетобактерий, молочнокислых стрептококков, ароматобразующих бактерий, обладающих исключительной способностью к саморегулированию своего состава [13, 14].

Нами разработан способ получения микробного консорциума путем длительной автоселекции микрофлоры кефирной грибковой закваски в присутствии термофильных лактобактерий Lactobacillus bulgaricus и Lactobacillus acidophilus , идентичных по составу микрофлоре курунги и кумыса [4].

Целью данного исследования было изучение биотехнологического потенциала полученного микробного консорциума.

Объекты и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали симбиотический микробный консорциум, полученный путем длительной автоселекции комбинированной закваски, состоящей из кефирной грибковой закваски и термофильных лактобактерии Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus bulgaricus в соотношении 1:0,5:0,5 соответственно. Автоселекцию комбинированной закваски проводили при 30 ° С при рН 4 -3,5.

Для исследований использовали:

• -    обезжиренное пастеризованное при 95 ° С с выдержкой 15 мин коровье молоко, охлажденное до 30 ° С;

• -    кобылье молоко, пастеризованное при 60 ° С с выдержкой 10 мин, охлажденное до 30 ° С.

Кислотность определяли по ГОСТ 54669-2011

Массовую долю спирта – пикнометрическим методом по ГОСТ 3629-47.

Количество молочной кислоты определяли методом Пиккеринга и Клега [5].

Количественный учет микроорганизмов проводили методом предельных разведений по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высевах на агаризованных лактозно-картофельном и глюкозно-картофельном средах для дрожжей, сбраживающих/несбраживающих лактозу соответственно, молочнокислых бактерий на среде ГМК по ТУ10-02-02-789-192-95.

Адгезивные свойства изучали на формалинизированных эритроцитах по развернутому методу В.И. Брилиса [1].

Антибиотическую активность определяли методом последовательных разведений по М.С. Полонскому. В исследованиях антибиотической активности использовали тест-культуры E. coli I53 and S. sonnei 2848 .

Результаты и их обсуждение

Развитие биохимических процессов и показатели качества кисломолочных продуктов зависят от состава и свойств микроорганизмов, а также от состава сквашиваемого молока. Ис- следовано влияние вида молока на биохимическую активность микробным консорциумом, полученного автоселекцией микрофлоры кефирной грибковой закваски в сочетании термофильных лактобактерий.

В подготовленное коровье и кобылье молоко вносили по 10% закваски на основе микробного консорциума. Сквашивание проводили при 30 ° С.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Биохимическая активность микробного консорциума

Исследуемые свойства	Характеристика показателей
	на коровьем молоке	на кобыльем молоке
Продолжительность сквашивания, ч	14-15	8-10
Титруемая кислотность,0Т	210-220	140-160
Активная кислотность, ед.	3,6 + 0, 1	3,9 + 0, 1
Массовая доля спирта, % об.	0,9 + 0,1	1,2 + 0,1
Массовая доля молочной кислоты, %	1,4 + 0,2	1,2 + 0,2
ЭПС, мкг/мл	15 +2
Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл: термофильные лактобактерии мезофильные лактобактерии дрожжи, сбраживающие лактозу дрожжи, не сбраживающие лактозу уксуснокислые бактерии	10 6 109 107 105 104	10 5 108 108 107 104
Органолептические свойства	Вкус кисломолочный, с дрожжевым привкусом, консистенция жидкая, хлопьевидная, слегка газированная	Вкус кисломолочный, с выраженным дрожжевым привкусом, консистенция жидкая, мелкодисперсная, хлопьевидная, газированная

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о способности полученного микробного консорциума к саморегуляции состава микрофлоры в зависимости от состава питательного субстрата. При ферментации кобыльего молока наблюдается увеличение количества дрожжей и повышение спиртообразующей активности, связанное, вероятно, с повышенным содержанием лактозы в кобыльем молоке. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования полученного микробного консорциума для производства курунги и кумыса.

Полученный микробный консорциум формирует характерные для курунги и кумыса органолептические свойства, обладает необходимой энергией кислотообразования и спиртооб-разования.

Антагонистическая активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры является важнейшей характеристикой микрофлоры курунги и кумыса. Поэтому была исследована антагонистическая активность созданного микробного консорциума в сравнении с кефирной закваской по отношению к тест-культурам E. coli I 53 и S. sonnei 2848. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Антибиотическая активность заквасок к E.coli I 53 и S. sonnei 2848

Вид закваски	Рост бактерий в разведениях
	E. coli I 53		S. sonnei 2848
	Отсутствие роста	Торможение роста	Отсутствие роста	Торможение роста
Кефирная закваска	1:4	1:32	1:4	1:64
Микробный консорциум	1:8	1:64	1:16	1:128

Как видно из данных таблицы 2, микрофлора микробного консорциума обладает наиболее выраженным по сравнению с кефирной закваской бактерицидным и бактериостатическим действием по отношению к E. coli I 53 и S. sonnei 2848.

Бактерицидное действие микробного консорциума по отношению к E. coli проявлялось в разведении 1:8, а к S. sonnei – 1:16, бактериостатическое действие в разведении 1:64 и 1:128 соответственно.

Адаптация к факторам внешней среды обеспечивается механизмами, гарантирующими стабильность микробного консорциума. К таким механизмам относятся межклеточная когезия и адгезия бактерий.

Адгезивные свойства микробного консорциума оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ), об адгезивности культур и микробного консорциума судили по индексу адгезивности микроорганизмов (ИАМ) [1].

Ранее нами были проведены исследования адгезиной активности микробного консорциума и динамика прироста экзополисахараидов (ЭПС) в процессе автоселекции микрофлоры кефирной закваски и термофильных лактобактерий [6]. Результаты сравнительной оценки адгезивной активности полученного микробного консорциума, кефирной грибковой закваски и чистых культур L. acidophilus и L. bulgricus представлены в таблице 3.

Таблица 3

Адгезивность микробного консорциума и чистых культур лактобактерий

Наименование опыта	СПА	КУЭ	ИАМ	Адгезивные свойства
L. acidophilus	3,3	78	2,9	среднеадгезивные
L. bulgаricus	1,73	72	2,4	низкоадгезивным
Кефирная грибковая закваска	3,3	74	4,4	высокоадгезивные
Микробный консорциум	3,8	78	4,8	высокоадгезивные

Из данных таблицы 3 следует, что лактобациллы по разному адгезируются к эритроцитам человека in vitro : индекс адгезивности был наиболее высоким у микробного консорциума – (4,8), кефирной закваски (4,4), средним у L. acidophilus (2,9), умеренным у L. bulgаricus (2,4).

Исследования биосинтеза ЭПС в процессе автоселекции микрофлоры кефирной грибковой закваски и термофильных лактобактерий для получения микробного консорциума представлены на рисунке.

о

Время,

ч

ЭПС рН

Рисунок - Динамика ЭПС и рН в процессе автоселекции микрофлоры кефирной закваски и термофильных лактобактерий

Из данных, представленных на рисунке, видно, что синтез ЭПС начинается с первых часов автоселекции и максимально концентрируется в стационарной фазе. Установленная динамика зеркально отражает динамику рН: прирост ЭПС по времени совпадает с резким снижением рН до 3,5, дальнейшее ведение автоселекционного процесса полунепрерывным культивированием стабилизирует рН среды и синтез ЭПС.

На основании этих данных можно считать, что изменения в динамике ЭПС связаны с процессами саморегуляции микрофлоры.

В начале автоселекционного процесса наблюдается уменьшение количества неустойчивых к низкой кислотности среды мезофильных молочнокислых палочек и стрептококков. Несмотря на неблагоприятные условия окружающей среды, популяции этих микроорганизмов сохраняются в небольших количествах в создаваемом микробном консорциуме [4].

Прирост ЭПС в исследуемых образцах в течение автоселекции можно рассматривать как стрессовый ответ формируемого микробного консорциума на изменения рН и температуры среды.

Одна из точек зрения на причину формирования симбиотических микробных сообществ исходит из предположения, что эти сообщества являются способом защиты микроорганизмов от неблагоприятных условий. Действительно, микроорганизмы в сообществах более устойчивы к различным воздействиям: изменениям рН, температуры, лимитированию субстратами и др. В таких сообществах между видами конкуренции не существует [2, 3, 8, 13].

Значительную роль в приобретаемой устойчивости играют ЭПС. Микроорганизмы в зависимости от конкретных условий существования синтезируют ЭПС различного состава и свойств. Экзогенные углеводы выполняют функцию саморегулятора процессов роста и развития, осуществляют важную трофическую функцию в экосистемах [3].

Адаптация микроорганизмов в микробных сообществах к экстремальным условиям культивирования приводит к формированию устойчивых симбиозов. Наличие симбиотических взаимоотношений в полученном микробном консорциуме подтверждаются высокой плотностью микрофлоры и биохимической активностью, способностью синтезировать антибиотические субстанции, ЭПС и др.

Выводы

• 1.    Полученный микробный консорциум формирует характерные для курунги и кумыса органолептические свойства, обладает необходимой энергией кислотообразования и спирто-образования.

• 2.    Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения микробного консорциума, идентичного по своему составу естественной популяции микроорганизмов ку-рунги и кумыса, обладающего высокой антибиотической активностью к патогенной микрофлоре.

• 3.    Установлены высокая адгезивная активность микробного консорциума и экзополиса-харидный потенциал, способствующий стабильности его состава.

Полученные результаты открывают широкие перспективы для применения микробного консорциума в производстве биологически активных добавок и кисломолочных продуктов.