Исследование гибридов картофеля ВНЦ РАН на наличие ДНК-маркеров устойчивости к вирусам и цистообразующей нематоде

Автор: Газданова Ирина Олеговна, Гериева Фатима Тамерлановна, Дзедаев Хетаг Тотразович

Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau

Статья в выпуске: 7, 2022 года.

Бесплатный доступ

Цель исследования - выявление генотипов картофеля с генами, контролирующими устойчивость к картофельной цистообразующей нематоде (Globoder arostochiensis и Globoder apallida), вирусам картофеля X (ХВК) и У (УВК) в гибридах картофеля ВНЦ РАН с использованием молекулярных маркеров. Анализы проводились в лаборатории молекулярного генетического исследования Владикавказского научного центра Российской академии наук с использованием приборно-аппаратной линии для проведения ПЦР-анализа. Селекционный материал был предварительно оценен в лабораторно-полевых условиях по наиболее важным хозяйственно ценным признакам в соответствии с «Методическими рекомендациями по технологии селекционного процесса для картофеля». ДНК выделяли из листьев образцов картофеля с использованием набором реагентов «ДНК-Экстран-3» для выделения ДНК из тканей растений компании OOO «Синтол». Для молекулярного скрининга образцов картофеля использовались ДНК-маркеры генов устойчивости к вирусу У: STS-маркер YES3-3A, сцепленный с геном Rysto, и SCAR-маркер RYSC3 гена Ruadg, STS-маркер Ry186 гена Rychc; против золотистой картофельной нематоды - SCAR-маркер гена H1 - TG 689, 57 R, N 195, STS-маркер Gro1-4-1 гена Gro1-4; против бледной картофельной нематоды - STS-маркер Gpa2-2 гена Gpa2 и против вируса картофеля X - STS-маркер PVX гена Rx1. Комбинация маркеров Gpa2-2 и PVX была обнаружена в 9 гибридных комбинациях. Молекулярно-генетический анализ гибридов картофеля показал, что маркер PVX гена устойчивости к вирусу X (Rx) был диагностирован в 18 образцах. Маркер RYSC3 гена Ryadg обнаружен у гибридов картофеля 7/6-18, 7/7-18, 7/16-18,7/21-18, 8/1-18. Ген H1 был подтвержден комбинацией из трех маркеров TG-689, 57R, N195 у 11 гибридных образцов картофеля. У всех исследуемых генотипов отсутствует специфический фрагмент размером 602 п.н. - маркер гена Gro 1-4.

Еще

Картофель, гибрид, устойчивость, ген, нематода, маркеры, вирус х, вирус у

Короткий адрес: https://sciup.org/140295599

IDR: 140295599 | DOI: 10.36718/1819-4036-2022-7-20-27

Текст научной статьи Исследование гибридов картофеля ВНЦ РАН на наличие ДНК-маркеров устойчивости к вирусам и цистообразующей нематоде

Введение. В странах с развитым картофелеводством в настоящее время средняя урожайность картофеля составляет 40,0 т/га, а в РСО-Алания средняя урожайность не превышает 20,0–25,0 т/га. Недобор урожая клубней связан со многими объективными и субъективными причинами [1–3]. Одной из причин низких урожаев картофеля является отсутствие собственного семенного материала и новых перспективных конкурентоспособных сортов, устойчивых к карантинным объектам, вирусным, бактериальным и грибным болезням, приспособленных к конкретным климатическим условиям [4, 5]. Опасность этих вирусов заключается в том, что они беспрепятственно распространяются в пределах сорта, приводя к полному поражению растений. Вирусные инфекции вызывают значительные потери при выращивании картофеля, поскольку патогены передаются с посадочным материалом и таким образом циркулируют в агроэкосистемах в течение длительного времени, вызывая высокие потери урожая – до 15–70 % [6, 7]. Основной проблемой в селекции картофеля является контроль вирусных инфекций, поэтому поиск источников устойчивости к вирусам является актуаль- ной задачей в селекции. Сложность селекции на устойчивость к вирусам заключается в наличии большого их разнообразия и малом числе сортов с комплексной устойчивостью [8].

В области селекции наиболее перспективно создание новых вирусоустойчивых сортов с использованием межвидовой гибридизации и внедрение их в производство. Создание устойчивой к вирусу сортоформы стало возможным только благодаря подбору устойчивых родительских форм и отбору всех устойчивых гибридов для всей дальнейшей работы [9–11].

Наряду с традиционной схемой селекции поиск эффективных исходных форм и перспективных гибридов картофеля с использованием методов маркер-вспомогательной селекции становится перспективным. Молекулярные маркеры (ДНК-маркеры), тесно связанные с генами устойчивости, интенсифицируют поиск ценных селекционных образцов и позволяют значительно увеличить выборку исследуемого материала при отборе генотипов с комплексом олигогенов, что существенно сокращает время создания новых сортов картофеля [12–15].

ДНК-маркеры используются для отбора образцов, потенциально устойчивых к цистообразующей нематоде, фитофторозу, к наиболее вредоносным вирусам картофеля Х и У [16]. В селекции картофеля наиболее эффективные молекулярные маркеры связаны с генами Ry sto , Ry adg и Ry chc , контролирующими иммунитет к YBK, генами Rx1, контролирующими иммунитет к XBK, и генами H1 и Gro1-4 для устойчивости к золотистой нематоде Globodera rostochiensis, что может стать эффективным инструментом для интенсификации селекционной работы. Их использование для выявления ценных генотипов, включая формы с несколькими генами устойчивости, может значительно повысить эффективность отбора на ранних этапах селекции [17, 18].

Цель исследования – выявление генотипов картофеля с генами, контролирующими устойчивость к картофельной цистообразующей нематоде ( Globodera rostochiensis и Globodera pallida ), вирусам Х (ХВК) и У (УВК) картофеля среди образцов коллекций и гибридов ВНЦ РАН с использованием молекулярных маркеров.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили гибриды картофеля отечественной селекции. Исследование выполнялось на базе лаборатории молекулярно-генетических исследований ВНЦ РАН с использованием приборно-аппаратной линии для проведения ПЦР-анализа. ДНК выделяли из молодых листьев полевых растений картофеля из селекционного питомника Владикавказского Научного Центра Российской академии наук (ВНЦ РАН) с исполь- зованием набором реагентов «ДНК-Экстран-3» (компания ООО «Синтол», Россия).

В исследовании использовались ДНК-маркеры, показывающие наиболее высокий уровень корреляции наличия амплифицированного фрагмента и устойчивости к патогену. Для молекулярного скрининга образцов картофеля использовали ДНК-маркеры генов устойчивости (табл. 1). ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 нг общей ДНК из сортов картофеля, 1× реакционный буфер (Диаэм, Москва), 2,5 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ каждого из dNTP, 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров и 1 единицу Taq-полимеразы. ПЦР проводили по стандартным методикам. Температуры отжига и условия циклирования соответствовали указанным разработчиками праймерам (см. табл. 1). Для повышения эффективности анализа несколько маркеров (Ry186, N 195, Gpa2-2) были объединены в одной мультиплексной реакции. GBSS-маркер Waxy (GBSSI) гена, контролирующего содержание амилопектина в крахмале, использовался в качестве внутреннего положительного контроля, указывающего на качество матрицы ДНК и правильность ПЦР. Мультиплексная ПЦР проводилась по следующей программе: 10 с при 94 °C (1 цикл); 30 с при 94 °C, 30 с при 68 °C, 1 мин при 72 °C, (5 циклов); 30 с при 94 °C, 30 с при 58 °C, 1 мин при 72 °C (35 циклов); 30 с при 94 °C, 5 мин при 72 °C (1 цикл). Присутствие специфического фрагмента определяли путем электрофоретического разделения продуктов амплификации в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Таблица 1

Ген	Маркер	Размер фрагмента (п.н.)	Tемпература отжига праймеров, ºС	Литературный источник
1	2	3	4	5
ДНК-маркеры устойчивости к вирусу Y
Ry adg	RYSC3	321	60	Kasai et al., 2000 [19]
Ry chc	Ry186	587	55	Hosaka et al., 2001 [20]
Ry sto	YES3-3A	341	55	Song et al., 2005 [19]
ДНК-маркеры устойчивости к Globodera rostochiensis
H1	TG 689	141	55	Бирюкова и др. 2008 [6]
	N 195	337	55	Mori et al. 2011 [18]
	57 R	450	63	Schultz et al., 2012 [21]
Gro1-4	Gro 1-4	602	60	Asanol et al., 2012 [22]

Окончание табл. 1

1	2	3	4	5
ДНК-маркеры устойчивости к Globodera pallida
Gpa2	Gpa2-2	452	60	Asanol et al., 2012 [22]
ДНК-маркер устойчивости к вирусу X
Rx1	PVX	1230	58	Mori et al., 2011 [18]

ДНК-маркеры, используемые для оценки генотипов картофеля

Результаты и их обсуждение. Молекулярный скрининг на наличие генов устойчивости проведен для 30 гибридов картофеля. В результате установлено, что в селекции картофеля на устойчивость в настоящее время используются близкородственные родительские формы, в родословной которых участвует один и тот же генетический источник, и имеются достаточно большие перспективы для расширения существующего генофонда.

В результате молекулярного скрининга гибридов селекции ВНЦ РАН установлено, что среди исследуемых образцов картофеля преобладают генотипы с маркерами генов H1 , Gpa2 и Rx1 и имеются достаточно большие перспективы для расширения существующего генофонда, поскольку в их происхождении в качестве родительских форм участвуют сорта картофеля, устойчивые к цистообразующей картофельной нематоде и вирусу Х (табл. 2).

Таблица 2

Гибрид

Происхождение

Наличие ДНК маркеров

О CO

o CO

X О

CD ОО co p

or lo

LO CD x—

О о

CXI CXI 05

CO co co

co О CO

or LO

Устойчивость к КЦН

Устойчивость к YВК и ХВК

1/2- 18

Nixe × Голубка

–

1/10-18

Nixe × Голубка

–

2/15-18

Red Scarlett × Голубка

–

2/18-18

Red Scarlett × Голубка

–

2/13-18

Red Scarlett × Голубка

–

2/22-18

Red Scarlett × Голубка

–

3/3-18

Romano × Голубка

–

4/7-18

El Mundo × Labadia

–

7_/6-18

Фрителла × Киви

–

7_/7-18

Фрителла × Киви

–

7/16-18

Фрителла × Киви

–

7/21-18

Фрителла × Киви

–

8/1-18

Lady Claire × Киви

–

8/8-18

Lady Claire × Киви

–

8/11-18

Lady Claire × Киви

–

Окончание табл. 2

9/11-18

144-3-2013 × Innovator

–

11/4-18

88.16/20 × Innovator

–

11/7-18

88.16/20 × Innovator

–

12/1-18

Ferrari × Бриз

–

12/12-18

Ferrari × Бриз

–

12/19-18

Ferrari × Бриз

–

13/13-18

El Beida × Бриз

–

13/17-18

El Beida × Бриз

–

17/2-18

VR 808 × Вымпел

–

17/7-18

VR 808 × Вымпел

–

17/18-18

VR 808 × Вымпел

–

17/20-18

VR 808 × Вымпел

–

17/22-18

VR 808 × Вымпел

–

18/21-18

Метеор × Вымпел

–

22/2-18

Метеор × Армада

–

Примечание: КЦН – картофельная цистообразующая нематода; YВК – Y вирус картофеля; ХВК – Х вирус картофеля; (+/–) – присутствие / отсутствие маркера.

Гибриды картофеля II года, устойчивые к патогенам, отобранные по результатам маркер вспомогательной селекции

Наличие гена H1 было подтверждено комбинацией трех диагностических маркеров TG-689, 57R, N195 у 11 гибридных образцов картофеля. Ген H1 придает устойчивость к двум патотипам золотистой нематоды Ro1 и Ro4.

У всех исследуемых генотипов отсутствует специфический фрагмент размером 602 п.н. – маркер гена Gro 1 (см. табл. 2). Маркер доминантного гена Gpa 2, который контролирует устойчивость к Globodera pallida , был идентифицирован в гибридах 1/2-18; 2/18-18; 2/13-18; 3/3-18; 3/17-18; 17/2-18;17/18-18; 17/20-18; 22/2-18. В исследованных гибридах все образцы с геном Gpa 2 также имели ген Rx1, поскольку ген Gpa 2 находится близко (менее 200 кб) к Rx1 и эти гены генетически сцеплены [18].

Молекулярный маркер RYSC3 гена Ryadg обнаружен у гибридов картофеля 7/6-18, 7/7-18, 7/16-18, 7/21-18 и 8/1-18, в происхождении которого участвует высоко-фертильная форма 128-6, сочетающая крайнюю устойчивость к Y вирусу картофеля c полевой устойчивостью к фитофторозу. Сорт Киви создан с участием формы 128-6 (от самоопыления беккроссов S. stoloniferum x S. tuberosumn). Интрогрессия маркера YES3-3A гена Rysto в гибриды происходит от сортов Метеор и Roko, полученных на основе S. stoloniferum. Маркеры генов Ryadg, Rysto встречаются реже, хотя имеют наибольшую селекционную ценность, поскольку обеспечивают оптимальную защиту картофеля ко всем пяти патотипам Ro1-Ro5 золотой картофельной нематоды и штаммам Y вируса картофеля соответственно. Маркер Ry186 гена Rychc отсутствует у исследуемых гибридов. Сопоставление результатов молекулярного скрининга с происхождением гибридов позволяет проследить интрогрессию R-генов от исходных (родительских) форм. Для дальнейшего прогресса в селекции генетическая база исходного материала должна быть дополнена включением новых источников генов устойчивости.

Заключение. Молекулярно-генетический анализ выявил новые источники генов устойчивости против картофельной цистообрующей нематоды и вирусных болезней картофеля. Полученные результаты свидетельствуют о селекционной ценности названных родительских линий. Наличие таких форм позволит обеспечить оптимальную защиту картофеля, а также ограничить распространение патогенов и предотвратить появление более агрессивных патотипов. В результате маркер-вспомогательной селекции среди перспективных гибридов из коллекции ВНЦ РАН выделены формы с комбинацией нескольких R-генов – 1/2-18, 2/13-18, 2/18-18, 4/7-18, 13/17-18, 22/2-18 – которые являются источниками групповой и комплексной устойчивости к картофельной цистообразующей нематоде, Y и Х вирусам картофеля и представляют интерес для целенаправленной селекции сортов картофеля с долговременной защитой к патогенам.

Список литературы Исследование гибридов картофеля ВНЦ РАН на наличие ДНК-маркеров устойчивости к вирусам и цистообразующей нематоде

Картофель: проблемы и перспективы / С.В. Жевора [и др.] // Картофель и овощи. 2019. № 7. С. 2-7.
Гериева Ф.Т., Газданова И.О. Эффективность применения перспективных биопрепаратов нового поколения в условиях Cеверо-Кавказского региона // Аграрный вестник Урала. 2021. № 3 (206). С. 2-9.
Рафальский С.В., Рафальская О.М., Мельникова Т.В. Изучение гибридных популяций картофеля в условиях Приамурья // Вестник КрасГАУ. 2021. № 6 (171). С. 18-24.
Диагностика и профилактика вирусных, бактериальных и грибных болезней, контролируемых в семеноводстве картофеля: метод. рекомендации / Б.В. Анисимов [и др.]. Владикавказ, 2021.
Газданова И.О., Дзедаев Х.Т., Моргоев Т.А. Биологическая защита картофеля в Республике Северная Осетия - Алания // Вестник КрасГАУ. 2022. № 1. С. 76-82.
Актуальные направления развития селекции и семеноводства картофеля в России / Е.А. Симаков [и др.] // Картофель и овощи. 2020. № 12. С. 22-26.
Хлесткина Е.К., Шумный В.К., Колчанов Н.А. Маркер-ориентированная селекция и примеры ее использования в мировом картофелеводстве // Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30 (10). С. 5-8.
DNA marker assisted evaluation of potato genotypes for potential resistance to potato cyst nematode pathotypes not yet invading into Japan / K. Asanol [et al.] // Breed. Sci. 2012.V. 62. P. 142-150.
Prodhomme C., Vos P., Paulo M.J., Tam-mes J.E., Richard G. F, Visser R.G.F., Jack H. Distribution of P1(D1) wart disease resistance in potato germplasm and GWAS identification of haplotype-specific SNP markers. Theoretical and Applied Genetics. 2020;133:1859-1871.
Синцова Н.Ф., Лыскова И.В., Сергеева З.Ф. Перспективные направления селекции картофеля на Фаленской селекционной станции // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2011. № 6 (25). С. 8-13.
Hirsch C.D., Hamilton J.P., Childs K.L, Cepe-la J., Crisovan E., Vaillancourt B., Hirsch C.N. A resource for mining sequences, genotypes, and phenotypes to accelerate potato breeding. Plant Genome. 2014;7:1-12.
Шестеперов А.А., Грибоедова О.Г. Создание нематодоустойчивых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур // Аграрная наука. 2019. № S2. С. 130-134.
Исследование коллекционных образцов картофеля на наличие генетических маркеров устойчивости к фитопатогенам / А.Б. Сайнакова [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2018. T. 22 (1). C. 18-24.
Устойчивость картофеля к вирусам: современное состояние и перспективы / С.С. Макарова [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017. № 21 (1). С. 62-73.
Lico C., Benvenuto E, Baschieri S. The twofaced Potato virus X: from plant pathogen to smart nanoparticle. Front. Plant Sci. 2015;6:1009.
Arif M., Azhar U., Arshad M., Zafar Y, Man-soorS., Asad S. Engineering broad-spectrum resistance against RnA viruses in potato. Transgenic Res. 2012;21:303-311.
Устойчивость картофеля к карантинным болезням / А.В. Хютти [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017. № 21 (1). С. 51-61.
Mori K, Sakamoto Y, Mukojima N, Tamiya S, Nakao T, Ishii T, Hosaka K. Development of a multiplex PCR method for simultaneous detection of diagnostic DNA markers of five disease and pest resistance genes in potato // Euphytica. 2011. V. 180. P. 347-355.
Kasai K., Morikawa Y., Sorri V.A., Valko-nen J.P.T., Gebhardt C., and Watanabe K.N. Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on a common feature of plant disease resistance genes // Genome. 2000. V. 43. P. 1-8.
Song Y.S., Hepting L., Schweizer G., Hartl L., Wenzel G., and Schwarzfischer A. Mapping of extreme resistance to PVY (Rysto) on chromosome XII using anther-culture-derived primary dihaploid potato lines // Theoretical and Applied Genetics. 2005. V. 111. P. 879-887.
Schultz L., Cogan N.O.I., McLean K., Dale M.F.B., Bryan G.J., Forster J.W., Slater A.T. Evaluation and implementation of a potential diagnostic molecular marker for H1-conferred potato cyst nematode resistance in potato (Solanum tuberosum L.) // Plant Breed. 2012. V. 131. P. 315-321.
Asano K., Kobayashi A., Tsuda S., Nishina-ka M., Tamiya S. DNA marker assisted evaluation of potato genotypes for potential resistance to potato cyst nematode pathotypes not yet invading into Japan // Breed. Sci. 2012. V. 62. P. 142-150.

Еще

Статья научная