Исследование гуморальных компонентов, стимулирующих остеогенез

Автор: Гребнева Ольга Леонидовна, Ковинька Михаил Александрович, Лунева Светлана Николаевна, Ларионова Татьяна Адиславовна, Овчинников Евгений Николаевич, Самусенко Дмитрий Валерьевич

Журнал: Гений ортопедии @geniy-ortopedii

Рубрика: Оригинальные статьи

Статья в выпуске: 2, 2012 года.

Бесплатный доступ

Изучали состав компонентов остеогенной фракции плазмы крови пациентов после костной травмы (основная группа, 10 человек) и аналогично выделенной фракции сыворотки крови соматически здоровых доноров (референтная группа, 10 человек). Исследовали содержание белков, белковых фракций, гидроксипролина, сиаловых и уроновых кислот, а также инсулиноподобного фактора роста - 1. Обнаружили, что фракция основной группы состоит из компонентов полипептидной и углеводной природы и содержит более чем в 20 раз большую концентрацию инсулиноподобного фактора роста - 1 при сравнении с фракцией референтной группы.

Остеогенез, плазма крови, инсулиноподобный фактор роста 1

Короткий адрес: https://sciup.org/142121554

IDR: 142121554

Текст научной статьи Исследование гуморальных компонентов, стимулирующих остеогенез

На сегодняшний день в клинической практике не теряет актуальности задача сокращения сроков лечения больных ортопедотравматологического профиля с помощью средств фармакологической коррекции. Среди таких средств широко ведутся исследования по применению компонентов крови [11, 14, 35]. На базе РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова проводятся исследования, посвященные стимуляции регенерации костной ткани с помощью компонентов крови от доноров с активным остеогенезом. Ранее была доказана в эксперименте эффективность способа стимуляции костеобразования с помощью компонентов плазмы крови с определенными физико-химическими свойствами [10], на основании чего разработана и апробирована в клинических условиях медицинская технология с применением компонентов аутоплазмы [12]. Хотя были получены первые положительные результаты, широкое применение предлагаемого способа сдерживает ряд факторов. Среди них – необходимость выявления механизмов реализации эффекта, в которые входит как идентификация слагаемых фракционированной плазмы, так и определение мишеней их действия. Известно, что сыворотка крови здоровых доноров не влияет на репаративный остеогенез [13]. Целью настоящего исследования явилось сравнение состава компонентов остеогенной фракции плазмы крови пациентов после костной травмы и аналогично выделенной фракции сыворотки крови соматически здоровых доноров.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Основную группу составили 10 пациентов в возрасте 25±2 года с закрытыми многооскольчатыми переломами длинных трубчатых костей конечностей, у которых забирали кровь спустя 12±2 суток после травмы для получения остеогенной фракции (ОФ). Материал для контрольных исследований был выделен из плазмы 10 человек без соматической патологии в возрасте 20-22 лет. Фракционирование плазмы крови с получением лиофилизи- рованного материала проводили в соответствии с ранее описанной процедурой [12]. В полученной фракции определяли содержание общего белка биуретовым методом, белковых фракций – с помощью электрофоретической системы «Paragon» (Beckman Coulter), гексуроновых кислот (ГУК) – по методу Дише в модификации Bitter T., Muir H.M. [20], сиаловых кислот (СК) – наборами «Сиалотест 100» (НПЦ «ЭКО-СЕРВИС», Россия), гидроксипролина

(ОН-про) – по методу [1] после предварительного гидролиза навески лиофилизированной пробы в 6 н соляной кислоте, ИФР-I – радиоиммунологическим методом с использованием наборов «IRMA IGF-I»

(IMMUNOTECH). Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона для независимых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Было обнаружено, что группы по содержанию общего белка сыворотки крови не отличаются (табл.1). Масса остеогенной фракции и содержание белка в материале основной группы имеет тенденции к более высоким величинам, но достоверных отличий обнаружено не было. Значительную часть выделенного материала составляет белок: до 95 % от массы анализируемой фракции в основной и до 91 % – в референтной группе (табл. 1).

Анализ белковых фракций показал, что в ОФ, в отличие от нормальной сыворотки крови, преимущественно содержатся белки с электрофоретиче- скими свойствами β- и γ-глобулинов (табл. 2).

Не было обнаружено различий между группами по содержанию сиаловых кислот, тогда как содержание гексуроновых кислот и гидроксипролина в ОФ основной группы было достоверно меньше референтных значений этих показателей (табл. 3).

Результаты исследований показали, что по содержанию ИФР-1 ОФ основной и референтной групп резко различаются; величины этого фактора роста у пациентов после травмы более чем в 20 раз превышают показатели экстрагируемого той же технологией ИФР-1 из сыворотки здоровых пациентов (табл. 4).

Таблица 1

Содержание белка в остеогенной фракции

Величина

Основная группа (n=10)

Референтная группа (n=10)

Общий белок сыворотки, г/л

Масса ОФ, мг

Общий белок ОФ, мг

Белок, % от массы ОФ

Общий белок сыворотки, г/л

Масса «ОФ», мг

Общий белок «ОФ», мг

Белок, % от массы «ОФ»

медиана

68,2

25,50

22,78

71,05

71,3

18,71

15,8

84,45

1 квартиль

63,9

21,15

16,59

66,30

69,7

15,45

13,4

76,73

3 квартиль

73,9

30,00

29,27

94,65

73,6

22,10

20,2

91,40

Таблица 2

Белковые фракции остеогенной фракции (n = 10) и нормальной сыворотки крови, %

Белковые фракци

Величина

Альбумины

Глобулины

α1

^

β

γ

Остеогенная фракция

медиана

5,65

1,65

13,25

37,60

38,00

1 квартиль

3,7

1,25

9,63

31,90

28,55

3 квартиль

8,9

3,35

14,33

43,30

45,65

Нормальные значения для сыворотки [15]

диапазоны значений

54-65

2-5

7-13

8-15

12-22

Таблица 3

Содержание гексуроновых, сиаловых кислот и оксипролина в ОФ, выделенной из эквиобъемного количества сыворотки крови, мкмоль

Величина

Основная группа (n=10)

Референтная группа (n=10)

ГУК

СК

ОН-про

ГУК

СК

ОН-про

медиана

0,458*

0,390

1,08*

0,720

0,390

3,22

1 квартиль

0,380

0,355

0,81

0,540

0,360

2,16

3 квартиль

0,633

0,555

1,97

0,960

0,450

4,37

* - показатели отличаются от значений референтной группы с р<0,05.

Таблица 4

Содержание ИФР-1 в остеогенной фракции в основной (n=10) и референтной (n=10) группах, нг

Группы

Медиана

1 квартиль

3 квартиль

Основная группа

1124*

935

1992

Референтная группа

48,6

20,3

174,8

* - показатель отличается от значения референтной группы с р<0,001.

ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаруженные нами данные по составу остеогенного начала сыворотки крови по большей части согласуются с литературными. К 70-м годам 20-го века было известно, что рострегулирующие свойства обеспечиваются недиализуемым активным началом, присутствующим в сыворотке крови и экстрактах травмируемых органов, связанным в основном с альбуминовой фракцией, устойчивым к лиофилизации и не строго видоспецифичным [13]. Выделенные нами компоненты плазмы по большей части обладают белковой природой, также не диализуются через мелкопористые фильтры, не теряют свойств после лиофилизации [10], не обладают строгой видоспецифичностью (неопубликованные данные). Однако значительную часть ОФ составляют не альбумины, а белки с электрофоретическими свойствами β- и γ-глобулинов. Возможно, этот феномен связан с тем, что остеоиндуктивное начало связано с альбуминами нековалентными связями; в этом случае в ходе процедуры выделения, включающей растворение осажденного материала в растворе 8 М мочевины, должна происходить диссоциация таких связей.

Исследование состава ОФ обнаружило меньшие, чем референтной группе, значения гексуроновых кислот и гидроксипролина, несмотря на то, что в этот период наблюдаются высокие значение этих показателей в сыворотке крови [2]. По-видимому, это объясняется тем, что данные метаболиты входят в состав соединений, обладающих отличающимися физико-химическими свойствами в исследованных группах; это ведет, например, к связыванию с различными транспортными белками.

На сегодняшний день известно, что мощными регуляторами регенерации костной ткани являются факторы роста, депонированные в костной ткани и циркулирующие в гуморальном русле [3, 4, 8, 17, 21, 28]. Среди них одно из ключевых мест занимает инсулиноподобный фактор роста – 1, и нами было обнаружено более чем 20-кратное превышение референтных величин концентрации этого фактора в ОФ основной группы, что предполагает его участие в реализации остеогенного эффекта сыворотки крови.

Известно, что ИФР-1 играет центральную роль в регуляции клеточного деления, необходим для оптимальной пролиферации и дифференцировки остеогенных клеток [25, 26, 32], стимулирует синтез костного коллагена и аппозиционный рост костного матрикса, а также вызывает синтез ДНК и репликацию клеток в линиях остеобластов [21]. Кроме того, ИФР-1 способен стимулировать рост костей посредством повышения канальцевой реабсорбции неорганического фосфата и образования 1,25-дигидроксивитамина D3 почками [22]. Однако действие этого фактора на регенерацию костной ткани неоднозначно; так, обнаружено, что ИФР-1 принимает участие в процессах костной резорбции: он вызывает образование интерлейкина (ИЛ)-6 и увеличивает количество остеокластов [29], а также активирует зрелые остеокласты [16].

Учитывая приведенные факты, ИФР-1 нельзя отнести к факторам, исключительно стимулирующим костеобразование. И в этом отношении на ИФР-1 похожи многие, если не все полипептиды из группы факторов роста. Один и тот же цитокин может быть как стимулятором, так и ингибитором митотической и пролиферативной активности клеток в зависимости от концентрации, дифференцировочного фенотипа клетки, времени инкубации и присутствия других регуляторов в среде [18]. Показано, что трансформирующий фактор роста бета (ТФРβ) оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию клеток линии С3Н/10Т1/2 лишь при условии повышенной экспрессии протоонкогена c-myc [26], что стимулируется целым рядом факторов роста [8]. Кроме того, ТФРβ через сеть внутриклеточных медиаторов способен активировать онкоген c-fos, играющий важнейшую роль в морфогенезе кости [27]. Однако при условии повышенной транскрипции этого онкогена ТФРβ ингибирует синтез ДНК, стимулированный эпидермальным фактором роста (ЭФР) и фактором роста тромбоцитарного происхождения (ФРТП) [33]. Имеются данные, свидетельствующие о зависимости действия факторов роста от дифференци-ровочного фенотипа клетки. Так, ТФРβ стимулирует рост предшественников остеобластов и ингибирует рост клеток остеосаркомы [31]. Фактор роста фибробластов (ФРФ) является митогеном для нормальных остеобластов, но ингибирует пролиферацию клеток остеосаркомы крысы [17]. Присутствующие (или индуцированные) другие факторы роста могут модулировать действие тестируемого фактора на нескольких уровнях. ФРФ стимулирует транскрипцию гена, кодирующего ТФРβ [30], а последний активирует ген, кодирующий рецептор ЭФР [28]. Основной ФРФ (оФРФ), ТФРβ1 и ФРТП ВВ уменьшают содержание мРНК ИФР-связывающего белка (СБ)-5 и самого белка в культуре обогащенных остеобластами клеток свода черепа эмбрионов крысы [24]; известно, что для ИФР-1 существует целая система ИФР-СБ, обладающих различными функциями в отношении активности ИФР-1 [4]. Обнаружена модуляция действия полипептидных регуляторов через влияние на экспрессию рецепторов. Например, ИЛ-1 вызывает высвобождение интерферона-γ, который повышает экспрессию рецепторов для фактора некроза опухоли (ФНО); ФРФ и ФРТП индуцируют рецепторы для ИЛ-1; ФНО, ФРТП и ЭФР модулируют активность рецепторов для ЭФР [28]. Этим далеко не исчерпываются возможности регуляции действия цитокинов на этапе рецепции. Так, обнаружено существование пептида – специфического ингибитора связывания ИЛ-1 с его рецептором [24]. Системные гормоны могут модулировать локальное костеобразование посредством регуляции синтеза и высвобождения костных факторов роста. Было обнаружено, что в различных системах костных клеток высвобождение ИФР-2 способны стимулировать ПТ,

1,25-дигидроксивитамин D3, 17β-эстрадиол [28]. С другой стороны, известны примеры активной модуляции эффектов гормонов факторами роста. Например, модулировать эффект паратирина вплоть до его отмены способны ТФРβ и оФРФ [23, 34].

Приведенные примеры свидетельствуют о пер-миссивности действия как каждого фактора роста, так и любого другого эффектора, т.е. о модуляции его действия другими факторами - наличием и концентрацией других эффекторов в среде, функциональным состоянием клетки-мишени и другими. Известны примеры неудачных попыток применения одного фактора роста, успешно себя зарекомендовавшего при использовании in vitro, в систему in vivo [8]. Видимо, это объясняется тем, что текущие адаптационные процессы, обладающие многокон-турностью [5], могут продолжать осуществление своей программы регенерации. Исходя из высокой стабильности феномена стимуляции костеобразования с помощью гуморальных компонентов доноров с активным остеогенезом [6, 9, 19], можно предположить, что его реализацию вызывает не одно активное вещество, а комплекс молекул, действующих по различным контурам и дублирующих действие друг друга. Данное предположение согласуется с представлениями о развитии адаптационных процессов в организме [5] и подтверждает -ся наличием остеоиндуктивного эффекта богатой тромбоцитами плазмы крови, содержащей набор известных (а может, еще и не известных) факторов роста [7, 11].

По современным представлениям, факторы роста и цитокины являются частью единого программного звена - коммуникативно-регуляторного интегративного аппарата (КРИА), который включает нервную, гормональную и иммунную системы. Деятельность трех интегративных систем тесно взаимосвязана. Так, установлено, что клетки иммунной системы регулируются гормонами и нейромедиаторами, и, наоборот, иммунная система посредством цитокинов и аутоантител направленно регулирует функции нервной и эндокринной систем; лимфоциты секретируют некоторые гипофизарные гормоны и их иммунологические копии, а нейроны головного мозга продуцируют инсулин [3].

Таким образом, результаты исследований показали, что в состав остеогенной фракции входят соединения полипептидной и углеводной природы. Обнаружено, что в ОФ входит инсулиноподобный фактор роста – 1 в концентрациях, более чем в 20 раз превышающих референтные величины. Мы полагаем, что остеогенная активность сыворотки крови обусловлена наличием комплекса гуморальных компонентов КРИА, в число которых входит ИФР-1, а также другие, пока еще не идентифицированные эффекторы.

Статья научная