Исследование химиочувствительности бластных клеток при остром миелоидном лейкозе в опытах in vitro

Материалы и методы. Бластные клетки получены из периферической крови пациента с вторичным полирезистентным к тера- пии ОМЛ. В дни забора образцов абсолютное содержание бластов в крови составляло от 28,0 х 10*9/л до 52,0 х 10*9/л. Всего проведено 3экспериментасисследованиемгенотоксич-ностинесколькихводорастворимыхпротиво-опухолевыхпрепаратовin vitro.Вэкспери-менте№ 1:припомощиклеточногосортера MoFloAstriosEQ(BeckmanCoulter)отсортиро-валипо520650CD34+клетокв2пробирки которыекультивировали(37°C,5 %CO2)в течение4сутокв5млполнойпитательной среды(ППС),содержащей:80 %RPMI-1640 10 %эмбриональнойтелячьейсыворотки 10 %оригинальнойсывороткибольного 10мклФГАи100ЕД/млпенициллина.Водну изпробпослепервыхсутокдобавилидецита-бинвконцентрации1160нгна1млсреды.Для оценкиегогенотоксичностинатомжесортере поокончаниикультивированияопределили количествоклеток,сохранившихжизнеспособ-ность,путёмоценкирезультатовмаркировки свободной ДНК. В экспериментах № 2 и № 3 0,5 мл цельной крови культивировали с 5 мл ППС. Через 24 часа в пробы эксперимента № 2 добавили децитабин в различных концентрациях (290 нг/мл, 580 нг/мл, 1160 нг/мл) в пробы эксперимента № 3 — даунорубицин (3400 нг/мл), а также его комбинацию с интерфероном альфа-2а в расчёте 3600 МЕ на 1 мл ППС. Далее пробы культивировали в течение 48 часов. Для оценки генотоксичности в этих экспериментах использовали МЯТ по следующей методике: в культуры добавлялось по 6 мкл/мл цитохалазина, через 24 часа клетки фиксировали, раскапывали по предметным стёклам и окрашивали по Романовскому-Гимзе. В каждом препарате подсчитывали по 100 бластных клеток с блоком цитокинеза. Оценка генотоксичности производилась по определению соотношения количества клеток с микроядрами к количеству «чистых» делящихся клеток, а также по общему количеству микроядер на 100 клеток.

Результаты. В результате эксперимента № 1 была апробирована методика культивирования отсортированных CD34+ бластных клеток ОМЛ из периферической крови. В связи с тем,что культивирование осуществлялось без специальных смесей цитокинов для роста CD34+ клеток, а также возможным повреждением при сортировке, погибших клеток в обоих пробах оказалось значительно больше, чем ожидалось. Тем не менее,в пробе с добавлением децита-бина живых бластных клеток оказалось почти в 2 раза меньше,чем в контрольной пробе (9330 и 17633 клеток соответственно), что подтвердило потенциальную информативность методики.

В эксперименте № 2 при концентрациях де-цитабина 0 нг/мл (контроль), 290 нг/мл, 580 нг/мл, 1160 нг/мл процент клеток, содержащих микроядра, составил 7, 12, 23, 37 при общем количестве микроядер 7, 16, 42, 72 соответственно. В эксперименте № 3 в контрольной пробе обнаружено 5 % клеток с микроядрами, в пробе с чистым даунорубицином — 30 % в пробе с добавлением интерферона — 37 %. Общее количество микроядер составило 5, 38 и 73 соответственно.

Выводы. 1. Культуры бластных клеток при ОМЛ, полученные из проб периферической крови, могут быть применены в качестве модели для оценки генотоксичности химиопрепаратов. 2. Клеточный сортер позволяет отобрать необходимое количество клеток с нужным для исследования фенотипом, а после культивирования с высокой точностью оценить их жизнеспособность. Однако, помимо необходимости применения дорогостоящего оборудования для длительного культивирования менее жизнеспособных после сортировки CD34+ клеток необходимо применение специальных многоцитокиновых сред и других расходных материалов не производимых на территории Российской Федерации, что требует разработки и изучения альтернативных методик. 3. МЯТ может быть использован для оценки генотоксичности химиотерапевтических препаратов в отношении бластных клеток периферической крови. При этом для адаптации и освоения методики отсутствует необходимость закупки дополнительного дорогостоящего оборудования и материалов.

4. Из результатов эксперимента № 2 следует, что концентрация препарата напрямую коррелирует с уровнем генотоксичности, что подкрепляет выводы о достаточной специфичности результатов таких исследований. В эксперименте № 3 комбинация дауноруби-цина с интерфероном показала в 1,5 раза более выраженное генотоксическое воздействие на бластные клетки по сравнению с только даунорубицином, что может быть одним из подтверждений прямого противоопухолевого действия препаратов интерферона-альфа. 5. Апробированные методики изучения бластных клеток после дополнительного изучения и совершенствования могут быть использованы в качестве одного из перспективных направлений развития планирования и индивидуализации противоопухолевой терапии не только при ОМЛ, но, возможно, и при других злокачественных новообразованиях. Освоение не требующего существенных затрат метода МЯТ для исследования химиочувствительности опухолевых клеток in vitro может способствовать ускорению внедрения в рутинную практику методов индивидуализированной терапии.