Исследование и оценка токсичности нанодисперсного оксида алюминия при многократной ингаляционной экспозиции

В течение последнего десятилетия нанотехнологии и наноматериалы активно внедряются в раз- личные сферы деятельности человека [Benefits and Applications]. Одним из наноматериалов, получивших широкую распространённость, являются наночастицы оксида алюминия (Al2O3). Данный

продукт наноидустрии используется в косметической промышленности [Robertson, Sanchez, Roberts, 2010]; в медицинской промышленности – в системах доставки лекарств, биосенсорах, ортопедических и зубных имплантах [Liu et al., 2011]; в химической промышленности – в качестве катализатора [Jodin et al., 2006]; в пищевой промышленности – как противослёживающая добавка, краситель, является компонентом эмульгаторов, консервантов, порошков для выпечки, соевых детских смесей, входит в состав противомикробных упаковок [Krewski et al., 2007].

Согласно результатам проведенного ранее исследования [Зайцева и др., 2018] наночастицы Al 2 O 3 обладают высокой степенью потенциальной опасности для здоровья человека, обусловленной их способностью генерировать активные формы кислорода [Bahadar et al., 2016; Chen, Yokel, Henning et al., 2008], вызывать летальные изменения в клетках [Arul Prakash et al., 2011], приводя к пато-морфологическим изменениям органов [Bal-asubramanyam et al., 2009; Pauluhn, 2009], влиять на протеомный профиль [El-Hussainy et al., 2016], а также инициировать генотоксический и канцерогенный эффекты [International Agency for Research on Cancer; Di Vergilio et al., 2010].

Учитывая широкий спектр применения в различных сферах деятельности человека и высокую потенциальную опасность наночастиц Al 2 O 3 , особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение токсических свойств данного наноматериала при различных путях поступления в организм.

Материалы и методы

Для проведения исследований использован порошок нандисперсного Al 2 O 3 (Aluminum (III) oxide, CAS 1344-28-1, номер продукта 718475) производства компании Sigma Aldrich (США). Для сравнительного анализа применен порошок мик-родисперсного Al 2 O 3 (Aluminum (III) oxide, CAS 1344-28-1, номер продукта 265497) производства компании Sigma Aldrich (США).

Оценка размера частиц Al 2 O 3 выполнена методом сканирующей электронной микроскопии на сканирующем микроскопе высокого разрешения S-3400N (HITACHI, Япония). Исследование и оценка удельной площади поверхности частиц порошков нано- и мик-родисперсного материала выполнены по методу Бру-науэра, Эммета и Тейлора на приборе ASAP 2020 (Micromeritics, США) после дегазации в вакууме при температуре 350°С в течение 3 ч.

Эксперимент выполнен на половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 250–300 г в соответствии с требованиями этического комитета ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения и в соот- ветствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных [Guide for the care…, 2011]. Экспериментальных животных в количестве 12 особей произвольно разделили на 2 группы по 6 особей: опытная группа – для исследования действия наночастиц, контрольная группа – содержалась в аналогичных условиях, но не подвергалась экспозиции. Моделирование ингаляционного поступления вещества в организм осуществляли в ингаляционной системе с интегрированным программным обеспечением с использованием камеры для всего тела (TSE Systems GmbH, Германия). Для генерирования аэрозоля использовали водную суспензию нанодисперсного Al2O3 в концентрации 125 мг/см3. Характеристика воздушных потоков в камере: приток воздуха – 10 дм3/мин; скорость подачи водной суспензии вещества – 0.4 см3/мин; отток воздуха – 10 дм3/мин; колебания давления внутри камеры – 0.4 мбар; температура в камере – 22-25°С. Пробы воздуха из камеры для определения концентрации тестируемого вещества отбирали ежедневно на фильтры АФА-ХП-10-1 на протяжении всей экспозиции со скоростью подачи 2 дм3/мин. Фактическая концентрация нанодисперс-ного Al2O3 в воздухе ингаляционной камеры в течение всего эксперимента в среднем составила 0.170±0.021 мг/м3. Экспозицию проводили ежедневно по 4 ч. в течение 10 дней. На период экспозиции животные корм не получали.

Исследование бионакопления алюминия проведено на примере сердца, лёгких, печени, почек, головного мозга и крови методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500cx (Agilent, США) с октопольной реакционной/столкновительной ячейкой, в качестве газа-реактанта использовали гелий. Расчет концентрации алюминия осуществляли с учетом массы органа.

После окончания последней экспозиции у экспериментальных животных отбирали образцы крови из хвостовой вены в объёме 3 см3. Биохимическое исследование крови проводили с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Humalyzer 2000 (Human GmbH, ФРГ) (определение количества лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и С-реактивного белка) и биохимического анализатора Keylab (BPC BioSed, Италия) (определение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), амилазы, общего и прямого билирубина, гамма-глутамилтрансферазы, креатинина, мочевины, щелочной фосфатазы (ЩФ)). Исследование гематологических показателей крови (количество лейкоцитов, тромбоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов, лимфоцитов, эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрита, средний объём эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитарной массе, индекс распределния эритроцитов, средний объём тромбоцитов) – с помощью автоматического анализатора Coulter Ac*T 5diff AL (Beсkman Culter, США).

Изучение патоморфологических изменений выполняли гистологическими методами исследования на примере сердца, лёгких, печени, почек и головного мозга. Отобранный материал фиксировали в 10%-ном растворе забуференного нейтрального формалина. Дегидратацию фиксированных кусочков тканей проводили в автоматическом гистологическом процессоре «Excelsior ES» (Thermo Scientific, Германия). Гистологические препараты изготавливали из парафиновых срезов толщиной 3–4 микрона, окрашивая по общепринятой методике гематоксилином и эозином в роботе-окрашивателе «Varistain Gemini ES» (Thermo Scientific, Германия). Полученные микропрепараты исследовали на светооптическом микроскопе Axio Lab A1 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты и их обсуждение

По результатам сканирующей электронной микроскопии тестируемых веществ установлен максимальный пик распределения частиц Al 2 O 3 по размеру, соответствующий диапазону 30–40 нм (доля 42% от общего количества частиц). Удельная площадь поверхности наночастиц Al 2 O 3 составила 113 м²/г.

При исследовании бионакопления алюминия установлено, что концентрация исследуемого вещества в лёгких, мозге и крови животных опытной группы превышает данный показатель относительно контроля в 55.20 (р<0.0001), 5.96 (р<0.0001) и 1.62 раза (р=0.002) соответственно.

Оценка результатов исследования биохимических показателей крови на 10-й день эксперимента позволила установить у крыс опытной группы достоверное увеличение уровней АЛТ, АСТ, ЛДГ и ЩФ относительно данных показателей у животных контрольной группы в 1.78, 2.77, 1.56 и 1.46 раза соответственно (р<0.01).

Гематологическим исследованием установлено достоверное увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов в 1.44 раза (р=0.019) и тромбоцитов в 1.22 раза (р=0.046) относительно данных показателей у животных контрольной группы.

Оценка морфологических изменений исследуемых тканей и органов животных опытной группы позволила установить следующие изменения, не выявленные у животных контрольной группы: в тканях головного мозга – субарахноидальное кровоизлияние; в тканях лёгких – выраженную гиперплазию лимфоидной ткани, эозинофилию инфильтрата и геморрагические инфаркты; в тканях сердца и печени – острое полнокровие.

Таким образом установлено, что ингаляционное воздействие аэрозоля водной суспензии нанодис-персного Al 2 O 3 в фактической концентрации 0.170±0.021 мг/м³ в течение 10 дней по 4 ч. не вызывает гибели экспериментальных животных. Бионакопление алюминия происходит в тканях лёгких, мозга и крови. Повышенные уровни АЛТ, АСТ, ЛДГ и ЩФ у животных опытной группы могут указывать на нарушение функций клеток печени [Макарова, Макарова, 2013], что подтвердилось гистологическими методами исследования. Выявленный гематологическим исследованием тромбоцитоз может являться результатом прямого действия наночастиц [Ilinskaya, Dobrovolskaia, 2013] и говорит о нарушении кровообращения, что может обусловливать острое полнокровие [Макарова, Макарова, 2013] сердца и печени и геморрагические инфаркты лёгких [Kroll, Afshar-Kharghan, 2012]. Гиперплазия тканей лёгких, вероятно, обусловлена воспалительным ответом [Pease, Rucker, Birk, 2016] на действие активных форм кислорода [Mittal et al., 2014], продуцированных наночастицами Al 2 O 3 . Субарахноидальное кровоизлияние головного мозга может указывать на возможные нарушения функций плотных контактов [Kim et al., 2006] и/или перицитов [Liu et al., 2012] гематоэнцефалического барьера.

Заключение

Исследование размера (30–40 нм) и удельной площади поверхности частиц (113 м²/г) подтвердило, что изучаемый образец Al 2 O 3 является наноматериалом. Данное вещество при многократном ингаляционном воздействии накапливается в лёгких, головном мозге и крови; вызывает тромбоцитоз, который приводит к геморрагическим инфарктам лёгких, острому полнокровию сердца и печени, также установлены такие патологические изменения, как гиперплазия в тканях лёгких и субарахноидальное кровоизлияние в головном мозге. Установленные изменения показателей АЛТ, АСТ, ЛДГ и ЩФ могут свидетельствовать о нарушении функций клеток печени.

Полученные результаты необходимо учитывать при разработке профилактических мер для производителей и потребителей продукции, содержащей наночастицы Al 2 O 3 .