Исследование эффектов солей лития в присутствии этанола на продукт окислительного повреждения ДНК плазмы крови здоровых лиц и больных алкоголизмом

У больных алкоголизмом часто выявляется окислительный стресс (ОС) [1, 2, 3], который можно идентифицировать по повышенному содержанию в плазме (или сыворотке) крови продуктов окислительной модификации белков (карбонилов белков) и липидов (продуктов ПОЛ) [2, 3]. В ряде работ в плазме крови больных алкоголизмом выявлено увеличение продукта окислительной модификации ДНК – 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина (8-OH-dG) [4, 5, 6]. Обнаружена корреляция повышенного уровня 8-OH-dG в плазме крови с тяжестью алкогольного абстинентного синдрома [6]. Повышение в крови 8-OH-dG связано с формированием и развитием ОС и происходит при различных патологиях [7, 8]. Это обусловлено, главным образом, поступлением продуктов окислительного повреждения ДНК в кровь в результате гибели клеток в тканях организма вследствие апоптоза и/или некроза, а также при гибели клеток крови, вирусов и бактерий на фоне сформировавшегося ОС [9, 10]. При алко- гольной зависимости этанол и его метаболиты являются факторами, способствующими развитию и поддержанию на высоком уровне состояния окислительного стресса в организме больного [2, 3], а инкубация крови здоровых лиц в присутствии этанола или его метаболита ацетальдегида in vitro увеличивает содержание окисленных белков и липидов в плазме крови [11]. Исследований влияния этанола in vitro на уровень 8-OH-dG плазмы крови до настоящего времени не проводилось.

Важной задачей является поиск веществ, способных снижать уровень окисленных биомолекул у пациентов. К таким веществам в первую очередь относятся антиоксиданты. Перспективными препаратами при лечении больных алкоголизмом с выраженными расстройствами аффективного спектра могут быть лекарственные средства на основе солей лития, содержащие в своем составе анионный компонент с антиоксидантной активностью.

Ранее мы показали, что при защите белков и липидов плазмы крови здоровых лиц от ток- сического действия этанола определенным протекторным потенциалом обладают аскорбат лития [12, 13], а также карбонат лития и сукцинат лития [13].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе проведено изучение действия аскорбата и сукцината лития in vitro на уровень маркера окислительного повреждения ДНК – 8-OH-dG – в плазме крови здоровых лиц и больных алкоголизмом при инкубации крови с 0,5%-ным этанолом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования являлась кровь 21 больного алкоголизмом, находящихся в состоянии абстиненции (основная группа), и 15 практически здоровых человек (контрольная группа). Средний возраст участников исследования составил 43,55±1,95 года. Больные поступили на лечение в наркологическое отделение НИИ психического здоровья Томского НИМЦ. Диагноз больных по МКБ-10 квалифицировался как «Психические и поведенческие расстройства в результате употребления алкоголя (синдром зависимости – F10.21 и синдром отмены – F10.30)». Участниками контрольной группы были здоровые лица, не состоящие на учете у психиатра или нарколога, не имеющие хронических соматических заболеваний в стадии обострения и не употребляющие алкоголь, по крайней мере, последние 10 суток перед исследованием.

Кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак с использованием стерильной системы однократного применения Vacutainer («Becton Dickinson», USA) с антикоагулянтом Sodium Hepаrin. Использовали аскорбат лития и сукцинат лития, синтезированные для данного исследования на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета [14, 15, 16]. Этанол и соединения лития растворяли в физиологическом растворе (натрия хлорид 0,9%, ОАО

Научно-производственный концерн «ЭСКОМ», Россия). Эффекты исследуемых соединений на уровень 8-OH-dG в плазме крови оценивали после инкубации крови с этанолом in vitro в присутствии аскорбата лития или сукцината лития. В контрольные пробы добавляли физиологический раствор (контроль без этанола) или физиологический раствор и этанол (контроль с этанолом). Конечная концентрация этанола в пробах составляла 0,5%, соединений лития – 1,2 ммоль/л в пересчете на ионы лития. Данная концентрация соединений лития соответствует терапевтической концентрации лития в крови пациентов при терапии аффективных расстройств и алкогольной зависимости с аффективными нарушениями. После инкубации в течение 1 часа при 37°С все пробы центрифугировали в течение 10 минут (3000 об/мин.). Полученную плазму замораживали и хранили при температуре -80°С до измерения в ней 8-OH-dG иммуноферментным методом по протоколу с использованием набора DNA Damage Competitive Elisa Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Измерение оптической плотности проб и расчет концентрации 8-OH-dG осуществляли на приборе Epoch (BioTek, USA).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistica-12». Для проверки согласия с нормальным законом распределения количественных показателей использовали критерий Шапиро–Уилка. Данные представляли в виде среднего значения и ошибки среднего (М±m). Для оценки достоверности различий в группах использовали параметрический критерий Стьюдента (Student, Т-test). Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенных экспериментальных исследований представлены в таблице и на рисунках 1 и 2.

Таблица

Влияние солей лития (1,2 мМ) в присутствии этанола (0,5%) на концентрацию 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (8-OH-OG, нг/мл) плазмы крови здоровых лиц и больных алкоголизмом, М±т

Группа	Контроль без этанола	Контроль с этанолом	Этанол + Li-аскорбат	Этанол + Li-сукцинат
Здоровые (n=15)	11,11±1,32	10,41±0,80 +р=0,653	11,28±0,89	10,58±0,69
Больные алкоголизмом (n=21)	12,91±0,58 *p=0,178	12,97±0,64 *p=0,011 +р=0,948	13,78±1,00 *p=0,083	13,96±0,95 * p=0,017

П р и м е ч а н и е. *p – Уровень достоверности различий между показателями здоровых лиц и больных алкоголизмом; + р – уровень достоверности различий между показателями в контроле без этанола и с этанолом в соответствующих группах доноров.

У больных алкоголизмом концентрация продуктов окислительной модификации ДНК в плазме крови по сравнению со здоровыми лицами оказалась повышенной. Между контрольными пробами без этанола была выявлена тенденция к повышению этого показателя у больных алкоголизмом относительно здоро-

Здоровые доноры

Больные алкоголизмом

Q К (контроль) @ Э (этанол)

□ Mean aMean±SE rMean±0,95 Conf. Interval

Рисунок 1. Концентрация продуктов окислительной модификации ДНК - 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина (8-OH-dG) в контроле с этанолом и без этанола в плазме крови в основной группе (больных алкоголизмом) и контрольной группе (здоровых доноров), нг/мл

Показано, что уровень значимости различий между контролем без этанола и контролем с этанолом в группе здоровых лиц составил р=0,653, а в группе больных алкоголизмом – р=0,948. То есть статистически значимых различий в уровне 8-OH-dG плазмы крови между пробами с этанолом и без него как у здоровых доноров, так и у больных алкоголизмом не обнаружено. Таким образом, этанол в концентрации 0,5% при инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С in vitro заметного влияния на уровень 8-ОН-dG плазмы крови не оказывает (табл., рис. 1).

Соли лития (аскорбат лития и сукцинат лития) статистически значимого эффекта на уровень 8-OH-dG плазмы крови не показали как в группе здоровых лиц, так и в группе больных вых лиц с уровнем значимости р=0,178. Сравнение контрольных проб с этанолом между группами больных и здоровых лиц показало статистически достоверную разницу между обеими группами с уровнем значимости р=0,011 (табл., рис. 1).

алкогольной зависимостью. Уровень значимости различий между контролем и пробами с аскорбатом лития у здоровых составил р=0,922, а у больных алкоголизмом – р=0,426. Между контролем и пробами с сукцинатом лития уровень значимости различий был равен р=0,724 в группе здоровых лиц и р=0,351 в группе больных алкогольной зависимостью.

Повышенный уровень 8-OH-dG плазмы крови в группе пациентов по сравнению с группой здоровых лиц сохраняется в присутствии аскорбата лития на уровне тенденции (р=0,083). В присутствии сукцината лития различия между концентрацией 8-OH-dG в основной группе и контрольной группе были достоверны, уровень значимости различий составил р=0,017 (табл., рис. 2).

Таким образом, мы обнаружили увеличение продуктов окислительной модификации ДНК – 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина (8-OH-dG) в плазме крови у больных алкогольной зависимостью, что согласуется с данными литературы [4, 5, 6]. Инкубация крови как больных алкоголизмом, так и здоровых лиц с 0,5%-ным этанолом in vitro в течение 1 часа при 37°С не приводит к изменению 8-OH-dG в плазме крови. Ранее было показано, что в таких условиях этанол приводит к окислительному повреждению белков и липидов плазмы крови у здоровых лиц [2, 11, 12], но не у больных алкоголизмом [12]. Вероятно, для увеличения продуктов окислительного повреждения ДНК в плазме при инкубации крови с этанолом in vitro требуются другие условия инкубации, в частности такие как более длительное время воздействия, другая концентрация этанола и др.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные экспериментальные исследования позволяют сделать вывод, что в плазме крови больных алкоголизмом концентрация 8-OH-dG увеличена по сравнению со здоровыми лицами. В отличие от белков и липидов плазмы крови ДНК в используемых экспериментальных условиях оказывается устойчивой к повреждающему воздействию этанола. Концентрация продукта окислительной модификации ДНК – 8-OH-dG – в плазме крови больных алкогольной зависимостью и здоровых лиц достоверно не изменяется как после инкубации крови с этанолом, так и в пробах с добавлением солей лития.