Исследование эритроцитов крови методом растровой электронной микроскопии

В Республике Саха (Якутия), как и в странах с преобладающим количеством азиатского населения, в настоящее время наблюдается рост почечной патологии среди детей. Для сравнения: в США распространение заболевания варьируется в пределах 2–10 %, тогда как в Азии – до 50 % (в Японии – 18–40 %) [1–3]. Известно, что среди многочисленных нефропатий гематурия является единствен- ным симптомом заболевания почек и мочевыводящих путей [4]. Так, при IgA-нефропатии (болезнь Берже) гематурия является одним из основных симптомов [5]. Причины возникновения, проявления заболевания с синдромом гематурии, в том числе болезни Берже, на клеточном и молекулярном уровнях в настоящее время изучены недостаточно.

В связи с этим важным является формирование новых методов иссле- дования морфологии эритроцитов при гематурии для развития диагностики и терапии заболевания с учетом активного внедрения сложного научно-технического оборудования, в том числе лазерной интерференционной и электронной микроскопии [6–7].

Использование возможностей современного оборудования, такого как растровый электронный микроскоп, позволит получить важную дополнительную информацию, которую можно использовать для внедрения новых методов комплексного исследования анализов крови в изучение и диагностировании почечных заболеваний с синдромом гематурии [4–5].

Материалы и методы

В данной работе предлагается новый метод исследования изменения морфологии клетки и выявления не-идентифицированных нанообъектов с помощью растрового электронного микроскопа (РЭМ) высокого разрешения JSM-7800F («Japanese Electron Optics Laboratory» – «JEOL», Япония) [8–9]. Прибор имеет термополевой эмиссионный катод Шоттки и супергибридную объективную линзу, значительно уменьшающую хроматические и сферические аберрации и существенно увеличивающую разрешение, особенно при малых ускоряющих напряжениях. Данный РЭМ оснащен системой «Gentle Beam», которая позволяет уменьшать скорость электронов падающего на образец пучка и ускорять испускаемые им электроны, что существенно улучшает соотношение сигнал/шум и качество изображения при низких ускоряющих напряжениях.

Данная система позволяет проводить исследования поверхностей эритроцитов в мазках крови и пробах мочи без напыления проводящих покрытий и без повреждения исследуемого объекта в течение времени, достаточного для того, чтобы сделать необходимые снимки, а также визуализировать на поверхности эритроцитов объекты размером 21 нм. Использование покрытий, толщина которых соизмерима с наноструктурами на поверхности клетки, ранее не давало возможности обнаруживать подобные объекты.

Рассматриваемый РЭМ, имеющий диапазон увеличения 25–1 000 000, позволяет исследовать объект при ускоряющем напряжении 0,1–30 кВ с разрешением порядка 1,2 нм при 1 кВ и 0,08 нм при 15 кВ. Устройство оборудовано 4-мя типами детекторов: верхний детектор электронов, верхний детектор вторичных электронов, детектор обратно отраженных электронов, нижний детектор вторичных электронов. В данной работе был использован нижний детектор, обеспечивающий регистрацию отраженных электронов, испускаемых при малых углах. Работа в этом режиме позволяет снизить эффект электростатического заряда на поверхности образца, что существенно улучшает качество изображения поверхности эритроцитов.

Во время исследований при подготовке мазков крови использовали венозную кровь, взятую натощак с помощью вакуумных систем забора крови. Максимальный диаметр образцов составлял 20 мм. Предварительно отбирали наиболее характерные эритроциты в мазках с помощью оптической микроскопии, что позволило сократить время и ресурсы основного исследования.

Исследования мазков крови проводили при ускоряющих напряжениях 1 и 2 кВ с подачей напряжения на исследуемый объект 8–10 В.

Результаты исследования

На растровом электронном микроскопе «JSM-7800F» фирмы «JEOL» в УНТЛ «Графеновые нанотехнологии» ЦКП АИЦ МНИОК СВФУ им. М. К. Аммосова были проведены исследования мазков крови больных детей с синдромом гематурии и детей контрольной группы, в результате которых были получены изображения эритроцитов (рис. 1–2).

Р и с. 1. РЭМ-изображения эритроцитов крови ребенка из контрольной группы F i g. 1. Controls red blood cells on SEM

Р и с. 2. РЭМ-изображения эритроцитов крови больного ребенка с синдромом гематурии F i g. 2. Hematuria red blood cells on SEM

На основе эмпирических данных исследований мазка крови методом РЭМ были проведены обработка и анализ результатов методами математической статистики.

Например, при проведении измерения диаметров каждого эритроцита на рис. 1–2 статистическая выборка составила 113 и 94 эритроцитов соот- ветственно. Для построения распределения размеров эритроцитов интервалы значений для линейных размеров эритроцита составляли 5–10 мкм с шагом 0,5 мкм. На рис. 3–4 представлены гистограммы распределения размеров эритроцитов крови детей контрольной группы и больных с синдромом гематурии соответственно.

Линейный размер эритроцитов в крови, мкм / The linear size of red blood cells, mcm

Р и с. 3. Гистограмма распределения размеров эритроцитов крови детей контрольной группы F i g. 3. Histogram of control red blood cells

Р и с. 4. Гистограмма распределения размеров эритроцитов крови больных детей с синдромом гематурии (при болезни Берже)

F i g. 4. Histogram of hematuria (IgA-glomerulonephritis) red blood cells

Clinical medicine                                                                               385

В обоих случаях распределения размеров эритроцитов имеют экстремальный характер и подчиняется закону нормального распределения. По результатам вычисления основных статистических характеристик были построены графики функций плотности распределения размеров эритроцитов в крови (рис. 5).

Контрольная группа / Control group

IgA-гломерулонефрит / IgA-glomerulonephritis

Линейный размер эритроцитов в крови, мкм / The linear size of red blood cells, mcm

Р и с. 5. Функция плотности распределения размеров эритроцитов крови больных детей с синдромом гематурии (при болезни Берже)

F i g. 5. Gaussian function of distribution of sizes red blood cells with hematuria (IgA-glomerulonephritis)

На рис. 5 представлены графики сравнения функций плотности распределения размеров эритроцитов для контрольной группы и группы больных с синдромом гематурии. В результате статистических исследований эритроцитов при сравнении контрольной группы и группы с заболеванием Берже методом математической статистики было выявлено, что распределение эритроцитов имеет вид оди- ночных пиков с одинаковыми значениями ширины на полувысоте пиков, смещенных относительно друг друга. Среднее значение линейного размера эритроцита мазков крови контрольной группы составило 6,912 мкм; больных с синдромом гематурии – 7,640 мкм.

На поверхности эритроцитов наблюдались также «светящиеся» объекты нанометрового размера (рис. 6 а–б).

а)

б)

Р и с. 6. «Светящиеся» нанометровые объекты различных размеров на поверхности эритроцитов крови при болезни Берже

F i g. 6. Nano size objects on red blood cells with hematuria (IgA-glomerulonephritis)

Обсуждение и заключения

Исследование мазков крови на растровом электронном микроскопе «JEOL JSM-7800F» показало, что при определенных заболеваниях наблюдаются изменения морфологии эритроцитов и наличие на их поверхности нанообъектов, что было невозможно обнаружить при исследованиях на электронных микроскопах раннего поколения. Можно предположить, что эти объекты имеют органическое происхождение, поскольку многие органические объекты являются диэлектриками и при изучении с помощью РЭМ могут быть видны как яркие светящиеся объекты. Нанообъекты имеют размеры, сходные с размерами малых вирусов [10–11] и могут являться подтверждением предположения о возможном вирусном этиологическом факторе заболевания Берже и других видов нефропатий. Выявление изменения линейных размеров эритроцитов в сторону увеличения при заболеваниях Берже по сравнению с размерами эритроцитов контрольной группы и группы больных другими видами нефропатии с помощью РЭМ без напыления исследуемых образцов является одним из наиболее точных методов исследования морфологии клеток крови и вносит существенный вклад в улучшение качества диагностирования данного заболевания (как правило, сложно диагностируемого).

Дальнейшее увеличение статистики и анализ объектов нанометровых размеров расширит знания о проявлениях заболевания и привнесет свой вклад в методах диагностирования заболеваний с синдромом гематурии.

Поступила 11.01.2016; принята к публикации 11.05.2016; опубликована онлайн 30.09.2016

Submitted 11.01.2016; accepted 11.05.2016; published online 30.09.2016