Исследование кинетики аланинаминотрансферазной активности в картофеле

Аминотрансферазы являются одними из ключевых ферментов обмена аминокислот и кетокислот. Они представлены как в тканях человека и животных, так и растений и микроорганизмов. По международной классификации их относят к классу трансфераз, подкласс переносящие азотистые группы, подподкласс аминотрансферазы. Наиболее известными их представителями являются аланин- и аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.2 и 2.6.1.1), катализирующие следующие реакции трансаминирования (рисунок 1)[1, 2].

При этом в клетках происходит синтез необходимых аминокислот из кетокислот, являющихся метаболитами гликолиза и цикла Кребса, либо наоборот превращение аминокислот в кетокислоты с последующим их использованием на энергетические нужды. Учитывая обратимость этих реакций, равновесия могут смещаться в ту или другую сторону в зависимости от потребностей клеток.

		COOH				COOH
CH 3	+	CO	аланинамино-	CH 3		CH NH 2
CH NH 2 COOH		CH 2		CO COOH	+	CH 2 CH 2 COOH
		CH 2 COOH	трансфераза
аланин		α-кетоглутаровая кислота		пировиноградная кислота		глутаминовая кислота
б
COOH CH 2	+	COOH CO	аспартатамино-	COOH CH 2		COOH CH NH 2
CH NH 2 COOH		CH 2		CO COOH	+	CH 2 CH 2 COOH
		CH 2 COOH	трансфераза
аспарагиновая кислота		α-кетоглутаровая кислота		щавелево-уксусная кислота		глутаминовая кислота
Рисунок 1. Реакции трансаминирования: а			– аланинаминотрансфераза; б –		аспартатаминотрансфераза

Эти ферменты (сокращенно АЛТ, АСТ) широко используются в медицинской диагностике заболеваний, связанных с цитолизом – гепатиты, инфаркты, т. к. они являются в основном внутриклеточными ферментами и их уровень в крови резко повышается при массивном цитолизе (разрушении клеток). В связи с этим их называют индикаторными ферментами [3-7].

В растениях эти ферменты выполняют аналогичные биохимические функции, однако гораздо меньше изучались, чем в организме человека и животных. Так, в работе [8] была изучена динамика активности АЛТ и АСТ при прорастании семян сои и было показано, что активность АЛТ в семядолях значительно повышается на третьи сутки проращивания, а через пять суток резко снижается (в три раза по сравнению с первыми сутками). Это связано, по-видимому, с тем, что семядоли значительно атрофируются к этому моменту. Однако активность АЛТ в проростках повышается в три раза на пятые сутки роста. Это может быть связано, по мнению авторов, с участием пирувата в синтезе глюкозы по реакциям глюконеогенеза [8-12]. Активность АСТ в семядолях также значительно повышается на третьи сутки, а на пятые сутки возвращается к исходным значениям. В проростках она также значительно повышается на 3-5 сутки. Авторы объясняют это необходимостью синтеза α-кетоглутарата, который занимает централь- ное место в синтезе аминокислот и затем белков, в том числе ферментов [8-12].

Однако в литературе не изучался более широкий ряд растительных объектов, а также кинетические параметры рассматриваемых ферментов. Поэтому целью настоящего исследования стало изучение активности и кинетических параметров АЛТ в растительном сырье. В качестве объекта исследования нами был выбран картофель.

Между тем, ранее было показано, что активность АЛТ может служить показателем свежести рыбного сырья [13-15]. Поэтому, изучение активности АЛТ в растительном сырье может представлять интерес при анализе пищевого сырья и контроле качества готовых продуктов, о возможном влиянии химических добавок, в частности, консервантов и образующихся из них вторичных метаболитов на ферментативную активность пищевых систем, что делает энзиматические исследования актуальными и приложимыми для решения практических задач пищевой промышленности.

По количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об активности фермента. Пировиноградную кислоту определяют колориметрически по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, приводящей к образованию окрашенного 2,4-динитрофенилгидразона (рисунок 2).

CH 3

CO  +

COOH пировиноградная кислота

- H 2 O

2,4-динитро-фенилгидразин

2,4-динитрофенилгидразон (красно-бурого цвета)

Рисунок 2. Цветная реакция пировиноградной кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином

Субстратная смесь, приготовленная следующим образом: в 100 мл фосфатного буфера с pH 7,4 растворяют 1,78 г DL-аланина (или 0,89 г α-аланина) и 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты (смесь хранится в замороженном виде); 0,02 %-й раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 1н HCl; 0,4н раствор NaOH. Фотоэлектрический колориметр ФЭК-Н-57 с зеленым светофильтром с λ = 540 нм и кюветами с рабочим расстоянием 10 мм; термостат на 38 °С; картофель.

Определение активности аланинаминотрансферазы

Навеска картофеля 2 г растиралась в ступке с 10 мл воды и полученный гомогенат фильтровался через бумажный фильтр. Затем к 0,2 мл фильтрата гомогената добавляли 0,5 мл субстратной смеси, выдерживали при температуре 38 ºС в течение 30 мин, после чего добавля- ли 0,5 мл раствора ДНФГ и через 15 мин 5 мл 0,4н NaOH. Определяли оптическую плотность раствора относительно холостой пробы, полученной при использовании вместо фильтрата гомогената 0,2 мл дистиллированной воды.

Формулы для расчетов

C = D мкмоль;             (1)

E- 1 ,

V = C мкмоль/мин,          (2)

t, где ε = 0,45; l = 1 см; t = 30 мин.

Коэффициент экстинкции ε определяется по ряду стандартных растворов, содержащих ДНФГ пировиноградной и α-кетоглутаровой кислоты. Результаты эксперимента приведены в таблице 1 и показаны на рисунке 3.

Т а б л и ц а 1

Численные результаты опытов

№ разведения	[ S ], ммоль/л	1/[ S ], л/ммоль	D 1	D 2	D средн	V средн, мкмоль/мин	1/ V , мин/мкмоль
1	1,429	0,7	0,165	0,150	0,1575	0,01167	85,71
2	0,714	1,4	0,140	0,150	0,145	0,01074	93,10
3	0,476	2,1	0,120	0,130	0,125	0,00926	108,00
4	0,357	2,8	0,125	0,100	0, 1125	0,00833	120,00
5	0,286	3,5	0,120	0,085	0,1025	0,00759	131,71
6	0,238	4,2	0,085	0,100	0,0925	0,00685	145,95
7	0,204	4,9	0,080	0,090	0,085	0,00630	158,82
8	0,179	5,6	0,080	0,075	0,0775	0,00574	174,19

Определены кинетические параметры аланинаминотрансферазы картофеля методом Лайнуивера-Берка: К m = 0,298 ммоль/л, V max = 0,0151 мкмоль/мин.

Из графика (рисунок 3) видно, что в области больших концентраций наблюдается небольшое отклонение графика вверх. Это может говорить о наличии субстратного ингибирования.

Рисунок 3. Определение активности аланинаминотрансферазы

Субстратное ингибирование (ингибирование избытком субстрата) можно рассматривать в качестве частного случая бесконкурентного ингибирования. Помимо изменения свойств среды при больших [ S ] причиной такого явления может быть образование неактивного комплекса с двумя молекулами субстрата ES 2 и тогда субстрат фактически играет роль бесконкурентного ингибитора, а кинетическая схема выглядит следующим образом:

S

^V = ^V max ------ ■     .

K m + [ S ] + [ S L

K _i

Тогда уравнение Лайнуивера-Берка будет иметь следующий вид:

1     1   fl   K    [ S ] )

=    1 + -m +^

V  V max V    [ S ]   K _; J

E + S _   w ES -----► E + P k-i

* c                 [ES] [S]

+ S        Ki= ------ t                         [ES2]

ES 2

,(3)

здесь K i – константа ингибирования субстратом, т.е. константа диссоциации двойного фер-мент-субстратного комплекса. Проведем для этого случая вывод уравнения Михаэлиса-Ментен:

V = k 2 [ ES ] ; V max = k 2 [ E ] , ;

k 1 [ E ][ S ] = ^k -1 [ ES ] + k 2 [ ES ] ;          (4)

[ E H k _ , + k ₂

[ ES ]        k ,       m ^.

Запишем уравнение материального баланса по ферменту, в котором в данном случае будет три слагаемых:

[ E ] o = [ E ] + [ ES ] + [ ES 2 ] = [ E ] + [ ES ] f 1 +^[ S ¹ '■

V K i 2 7

Выразим отсюда [ E ] и подставим в выражение константы Михаэлиса:

При этом на графике Лайнуивера-Берка в области больших концентраций субстрата наблюдается отклонение от линейности, и на графике, как в нашем случае, будет наблюдаться минимум (см. рисунок 3).

Для того чтобы найти [ S ], соответствующую минимуму, продифференцируем обратную скорость (обозначим ее y ) по обратной концентрации (обозначим ее x ). В точке экстремума производная обращается в ноль. Исходя из этого, находим [ S min ]:

_ = y;

V [ S ]

У = — ^{1 + K} m x +— ; (8)

Vmax V dy = _LfK + * 1=JLfK -[St' dx  Vmax V  m  X2 Ki J  V,,, V m   Ki

[ s min ] = K K Ki^ ;

K i =

= 0;

[ E ] , - [ ES ] ' ' +^K

[ ^ES ]

[ S ]

—= K m ;    (5)

[ s ]^[ E ^]0- = k + [ S ] ^K L±I S 1

^{L J} [ ES ]      m ^{L J} K i

.

Теперь выразим отсюда [ ES ] и преобразуем выражение в форму, похожую на уравнение Михаэлиса-Ментен:

[ ^ES ] = [ ^E ]>

[ S ]

^K m + [ ^S ] [ 1 + [ - ]

V K J

Непосредственно по графику рассчитать K i невозможно, т.к. на первом участке кривой зависимость не является линейной. Однако в точке минимума на графике Лайнуивера-Берка производная d(1/ V )/d(1/[ S ]) обращается в ноль. Отсюда следует, что K i = [ S min ]²/ K m . Это дает возможность рассчитать константу ингибирования исходя из точки экстремума на графике.

Кинетические параметры реакции определяются экстраполяцией линейного участка графика в области малых концентраций до пересечения с осями, как и в обычном случае.

Для проверки предположения об ингибировании субстратом мы провели опыт, взяв меньшее количество фермента (1,5 г картофеля в том же объеме воды) и увидели явное отклонение вверх при больших концентрациях субстрата, что подтверждает предположение о субстратном ингибировании. Результаты эксперимента представлены в таблице 2 и показаны на рисунке 4.

Т а б л и ц а 2

Численные результаты опытов

№ разведения	[ S ], ммоль/л	1/[ S ], л/ммоль	D 1	D 2	D средн	V средн, мкмоль/мин	1/ V , мин/мкмоль
1	1,429	0,7	0,165	0,150	0,1575	0,01167	85,71
2	0,714	1,4	0,140	0,150	0,145	0,01074	93,10
3	0,476	2,1	0,120	0,130	0,125	0,00926	108,00
4	0,357	2,8	0,125	0,100	0, 1125	0,00833	120,00
5	0,286	3,5	0,120	0,085	0,1025	0,00759	131,71
6	0,238	4,2	0,085	0,100	0,0925	0,00685	145,95
7	0,204	4,9	0,080	0,090	0,085	0,00630	158,82
8	0,179	5,6	0,080	0,075	0,0775	0,00574	174,19

300 250	♦
200
150
100
50
—♦   0

-5              0              5              10

1/[S], л/ммоль

Рисунок 4. Определение активности аланинаминотрансферазы

Из графика, показанного на рисунке 4, видно, что минимум на графике Лайнуивера-Берка соответствует четвертому разведению, т.е. [S]min = 0,357 ммоль/л. Это позволяет вычислить константу ингибирования субстратом по формуле Ki = [S]2min /KM = 0,428 ммоль/л. Константа Михаэлиса здесь определяется экстраполяцией линейной части графика в области малых концентраций субстрата до пересечения с осями и она численно совпадает с определенной в первом опыте. Однако Vmax = 0,0128 мкмоль/мин, что меньше, чем в первом опыте, т.к. использовалась меньшая масса картофеля и соответственно меньшее количество фермента.

Аналогичная ситуация наблюдалась в работе [16] для АЛТ чеснока, для которой были найдены K M = 0,0206 ммоль/л и K i =0,0777 ммоль/л. Отсюда видно, что сродство к субстрату для АЛТ чеснока гораздо больше, чем для картофеля.