Исследование малатдегидрогеназы лекарственных растений семейства гречишные

Шаталаев Иван Федорович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета.

Гречишные, что позволит в перспективе обосновать оптимальные условия сушки лекарственного растительного сырья горца птичьего и горца перечного с целью максимальной сохранности биологически активных веществ.

Для достижения цели решались следующие конкретные задачи:

• -    определение структурных особенностей (изоферментного спектра) и относительной активности молекулярных форм малатдегидрогеназы в лекарственном растительном сырье горца птичьего и горца перечного;

• -    установление зависимости «активность малатдегидрогеназы – содержание действующих веществ группы флавоноидов».

В качестве объектов исследования использовались образцы воздушно-сухого лекарственного сырья травы горца птичьего и горца перечного, высушенные при температуре 30 оС, а также образцы промышленной заготовки, высушенные при температуре 60 оС.

Для выявления структурных особенностей маладегидрогеназы, фракционного состава неспецифических белков применяли метод электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле [5, 6]; количественное определение флавоноидов в исследуемых образцах проводили методом спектрофотометрии [3].

Во всех образцах сухого лекарственного растительного сырья вне зависимости от условий сушки активность малатдегидрогеназы не выявлялась.

Исследуемые образцы сырья выдерживали в условиях повышенной влажности при температуре 200С в течение 120 час [5].

В образцах сырья горца птичьего наблюдали следующие особенности проявления активности малатдегидрогеназы:

• -    после 24 часов экспозиции в условиях повышенной влажности в образцах воздушно-сухого сырья отмечали две активные зоны, отличающиеся по относительной электрофоретической

подвижности: МДГ-1 и МДГ-2. В зоне активности МДГ-1 находится одна молекулярная форма с ОЭП=0,65. Зона активности МДГ-2 представлена тремя молекулярными формами, причем относительная активность молекулярной формы с ОЭП=0,44 составляет 71,3%.

В образцах сырья горца птичьего промышленной сушки после аналогичной экспозиции активность малатдегидрогеназы не выявлялась:

• -    после 72 часов экспозиции в условиях повышенной влажности – в воздушно-сухом сырье отмечали также две активные зоны, каждая из которых представлена одной молекулярной формой: МДГ-2 с значением ОЭП=0,41 и высокомолекулярная МДГ-3 с ОЭП=0,21. Преобладает активность МДГ-2 – значение относительной активности составляет около 99%.

В образцах промышленной сушки после экспозиции 72 часов малатдегидрогеназа выявляется в виде зоны МДГ-2, представленной одной молекулярной формой (ОЭП=0,39).

При выдерживании образцов сырья горца птичьего в условиях повышенной влажности в течение 120 часов: для воздушно-сухого сырья также отмечали две активные зоны МДГ-2 и высокомолекулярную МДГ-3. Каждая зона была представлена одной молекулярной формой со значениями ОЭП 0,2 и 0,53; при этом значительно преобладала активность МДГ-2 – значение относительной активности 96%.

В образцах промышленной сушки при аналогичной экспозиции отмечали две зоны активности МДГ-2 и МДГ-3, в каждой зоне по одной молекулярной форме со значениями ОЭП, близкими значениям ОЭП для образцов воздушносухого сырья. Относительная активность МДГ-2 составляла 38,3%, МДГ-3 – 61,7%, т.е. наблюдалось значительное снижение активности МДГ-2.

Таким образом, изоферментные спектры малатдегидрогеназы горца птичьего в образцах воздушно-сухого сырья и сырья промышленной сушки после экспозиции в условиях повышенной влажности в течение 120 часов были практически идентичными, однако для сырья промышленной сушки характерно существенное преобладание активности высокомолекулярной МДГ-3.

Для образцов сырья горца перечного отметили следующие закономерности структурной организации МДГ.

После 24 часов экспозиции в условиях повышенной влажности в образцах воздушно-сухого сырья отмечали одну активную зону МДГ-3, представленную одной молекулярной формой с ОЭП=0,2. К 72 часам экспозиции выявлялось две активных МДГ-2 и МДГ-3. При этом МДГ-2 включает три молекулярных формы, относительная активность молекулярной формы с ОЭП=0,5 составляла 54%, и она характеризуется как основная. Активная зона МДГ-3 включала одну молекулярную форму со значением ОЭП 0,14 и невысокой относительной активностью.

После экспозиции 72 часов зона активности МДГ-2 была представлена одной молекулярной формой с ОЭП 0,45; высокомолекулярная МДГ-3 также представлена одной молекулярной формой, активность которой преобладает над активностью МДГ-2.

В образцах лекарственного растительного сырья горца перечного промышленной сушки активность малатдегидрогеназы начинает проявляться после 120 час экспозиции в условиях повышенной влажности. На электрофореграммах образцов отмечается активная зона МДГ-3 с одной молекулярной формой (ОЭП=0,18).

Для малатдегидрогеназы горца перечного в образцах воздушно-сухого сырья характерна гетерогенность: выявляются две активные зоны МДГ-2 и МДГ-3, при этом в зоне МДГ-2 обнаруживается до трех молекулярных форм. Малатдегидрогеназа горца перечного в образцах промышленной сушки представлена только одной высокомолекулярной формой МДГ-3.

Изменение изоферментного спектра и смещение активности в область высокомолекулярных форм МДГ можно объяснить двумя причинами: либо в ходе выдерживания растительного сырья во влажной среде происходит ассоциация олигомеров, так как известно, что МДГ является олигомерным ферментом [6]; либо выдерживание в условиях повышенной влажности способствует извлечению при пробоподготовке образцов высокомолекулярных форм МДГ [7].

Литературные данные свидетельствуют о том, что активизация МДГ-3 характерна для большинства растений после цветения и вплоть до их отмирания [6, 7]. Высокая активность МДГ-3 указывает на преобладание процессов окисления малата и в целом на мобилизацию окислительных процессов, что может оказывать влияние на уровень вторичных метаболитов, к числу которых относятся многие группы действующих веществ лекарственных растений (например, флавоноиды) [6. 7].

В проводимом исследовании исходили из предположения, что относительная активность МДГ-3 в сырье изучаемых горцев определяется режимом сушки [1, 3, 6]. Нами был проведен корреляционный анализ между двумя параметрами «относительная активность МДГ-3» и «содержание суммы флавоноидов» для образцов травы горцев птичьего и перечного.

Использовали непараметрический корреляционный анализ – определяли коэффициент Спирмена R (рекомендованный для количественных переменных, закон распределения которых не известен или не является нормальным [2]); программа Statistica 6.0.

Результаты корреляционного анализа представлены в таблицах 1 и 2:

Значение коэффициента Спирмена -0,81 свидетельствует о том, что для лекарственного сырья

Таблица 1 . Относительная активность МДГ-3 и содержание суммы флавоноидов в сырье горца птичьего

Горец птичий
Воздушно-сухое сырье		Промышленная сушка		Коэффициент СпирменаR
ОА МДГ-3, %	Содержание флавоноидов, %	ОА МДГ-3, %	Содержание флавоноидов, %
4,4	7,73	61,7	3,33	-0,81

Таблица 2. Относительная активность МДГ-3 и содержание суммы флавоноидов в сырье горца перечного

Горец перечный Воздушно-сухое сырье Промышленная сушка Коэффициент СпирменаR ОА МДГ-3, % Содержание флавоноидов, % ОА МДГ-3, % Содержание флавоноидов, % 61,4 1,78 100,0 1,07 -0,43 горца птичьего существует сильная корреляция (|R|≥0,75) между относительной активностью МДГ-3 и содержанием суммы флавоноидов. Наблюдается закономерность: при высоком уровне активности МДГ-3 в растительном сырье снижается содержанием суммы флавоноидов.

Для растительного сырья горца перечного характерна аналогичная закономерность, однако, характер корреляции по общепринятой классификации относится к умеренной – величина коэффициента Спирмена --0,43 (0,25≤|R|≤0,75).

Таким образом, подтверждается предположение о взаимосвязи характера активности МДГ в исследуемом лекарственном растительном сырье и содержанием суммы флавоноидов.

Показатель относительной активности МДГ-3 в траве горца птичьего и горца перечного может быть использован как маркер оптимального режима сушки вышеуказанного растительного сырья. В перспективе с использованием данного показателя возможно будет предложить рекомендации по режиму сушки и хранения лекарственного растительного сырья, обеспечивающему сохранность действующих веществ – флавоноидов.

Таким образом, на основании вышеизложенного можно сделать следующие выводы:

• -    в лекарственном растительном сырье – горца птичьего трава и горца перечного трава –вы-явлены молекулярные формы фермента малатдегидрогеназы: для горца птичьего – три активные зоны МДГ-1, МДГ-2 и высокомолекулярная МДГ-3; для горца перечного – две активные зоны – МДГ-2 и высокомолекулярная МДГ-3;

• -    изоферментные спектры малатдегидрогеназы горца птичьего в образцах воздушно-сухого сырья и сырья промышленной сушки после экспозиции в условиях повышенной влажности в течение 120 час практически идентичны: представлены МДГ-2 (одна молекулярная форма) и МДГ-3 (одна молекулярная форма). Однако для

сырья промышленной сушки характерно существенное преобладание активности высокомолекулярной МДГ-3;

• -    для малатдегидрогеназы горца перечного в образцах воздушно-сухого сырья характерна гетерогенность: выявляются две активные зоны МДГ-2 и МДГ-3, при этом в зоне МДГ-2 обнаруживается до трех молекулярных форм. Малатдегидрогеназа горца перечного в образцах промышленной сушки представлена только одной высокомолекулярной формой МДГ-3;

• -    для лекарственного растительного сырья – горца птичьего трава и горца перечного трава при различных способах сушки установлена закономерность: при высоком уровне относительной активности МДГ-3 в растительном сырье снижается уровень содержания суммы флавоноидов.