Исследование методов экстракции ДНК из объектов растительного происхождения и продуктов питания на их основе

Новоселова М.В., Шевякова К.А., 2014

Анализ качества продуктов питания является непростой задачей. Главная причина затруднений - их многокомпонентность и индивидуальность [8].

Сравнительно недавно основное значение в оценке качества пищевых продуктов придавали сенсорным методам, основанным на анализе ощущений органов чувств человека [6]. За последние десятилетия в мире разработаны современные высокоэффективные методы определения качества и безопасности пищевой продукции, основанные на применении последних научных достижений. Особое место занимают методы, опирающиеся на достижения молекулярной биологии и генетики [4].

Одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии стало открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это позволило поднять контроль качества и безопасности плодово-ягодного сырья и пищевых продуктов на его основе на новый уровень [7]. ПЦР - это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. К основным достоинствам данного метода анализа относят: специфичность; универсальность (может применяться практически любые материалы); высокая чувствительность (возможно выявлять единичные копии ДНК); малый объем биологического материала (проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров); высокая скорость получения результата анализа [2].

ПЦР-анализ состоит из трех основных процедур: подготовка пробы исследуемого материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК и ее очистке; амплификация (собственно ПЦР) и детекция продуктов амплификации [7].

Выделение и очистка нуклеиновых кислот - это первый шаг в большинстве молекулярно-биологических исследований ДНК, в том числе и полимеразной цепной реакции. В основе выделения нуклеиновых кислот лежат как физические, так и химические процессы. При экстракции ДНК из растительных объектов необходимо не только дезактивировать клеточные ферменты, но и «удалить» запасные вещества, например, полисахариды и вторичные метаболиты, такие как алкалоиды, фенольные соединения, терпены, которые не просто мешают изолированию ДНК, но и отрицательно влияют на ее качество. Качество и чистота нуклеиновых кислот относятся к наиболее важным факторам ПЦР анализа. Для того чтобы получить высокоочищенные нуклеиновые кислоты, не содержащие ингибирующих примесей, необходимо использовать наиболее подходящие методы выделения [1].

Целью настоящего исследования являлось выявление эффективного метода выделения ДНК из объектов растительного происхождения и продуктов питания на их основе.

В качестве объектов исследования использовались ДНК фруктов и ягод: малины, земляники, крыжовника, шиповника, вишни/черешни, банана, киви, а также пищевые продукты, самостоятельно изготовленные на их основе.

Исследуемые образцы пищевых продуктов или их компоненты готовили для извлечения из них ДНК, удаления примесей, которые могут ингибировать ПЦР. Для этого измельчение проводили с помощью стерильного скальпеля, ножниц и одноразового шпателя и гомогенизировали в керамической ступке.

Степень чистоты выделенных нуклеиновых кислот определяли с помощью спектрофотометрического метода анализа, основанного на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области спектра.

Извлечение ДНК проводили тремя разными методами:

• 1.    Фенольной экстракцией, которая рекомендуется для быстрого выделения небольших количеств геномной ДНК растений.

• 2.    С применением коммерческого набора «ПРОБА-ЦТАБ» - комплект реагентов для выделения растительной ДНК (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва).

• 3.    С применением коммерческого набора «Сорб-ГМО-А» (ЗАО «Синтол», Москва).

В ходе исследования все рассмотренные методы позволили выделить ДНК из исследуемых образцов, независимо от используемого объекта. В таблице 1 представлена сравнительная характеристика методик выделения ДНК из плодово-ягодного сырья.

Таблица 1

Сравнительная характеристика методик выделения ДНК из плодово-ягодного сырья

Параметры сравнения	Методика
	с дополнительной экстракцией фенолом	«проба-цтаб»	«Сорб-ГМО-А»
1	2	3	4
Масса навески, мг	100-150	100-150	100-150
Время проведения выделения, час	2,50 ± 0,02	1,00 ± 0,01	1,00 ± 0,01
Очистка ДНК	растворители	сорбент	сорбент

Продолжение табл. 1

1	2	3	4
Температура инкубации, °C	65,00 ± 0,39	65,00 ± 0,39	60,00 ± 0,36
Время перемешивания вручную, мин	19,00 ± 0,11	-	-
Время центрифугирования за весь период выделения, мин	23,00 ± 0,14	16,00 ± 0,09	9,50 ± 0,06
Условия хранения пробы	+ 20,00 ± 0,12 °С 12 часов	- 20,00 ± 0,12 °С 6 месяцев	- 20,00 ± 0,12 °С 6 месяцев

Во всех трех методах выделения ДНК масса навески различалась незначительно. В первых двух методах с дополнительной экстракцией фенолом и применением коммерческого набора «ПРОБА-ЦТАБ» температура инкубации составила 65± 0,39 °С, что на 5 °С выше, чем в третьем случае с применение коммерческого набора «Сорб-ГМО-А» (температура инкубации 60,00 ± 0,36 °С). После лизиса образцы центрифугировали. Время центрифугирования в случае применения набора «Сорб-ГМО-А» составило 9,50 ± 0,06 мин, что в два раза меньше чем в методах с применением фенола и набора «ПРОБА– ЦТАБ», время центрифугирования которых 23,00 ± 0,14 мин и 16,00 ± 0,09 мин соответственно. Скорость центрифугирования на этапах выделения ДНК в случае с дополнительной экстракции с фенолом составила 12 тыс. об/мин, в методе с применением набора

«ПРОБА‒ЦТАБ» – 13 тыс. об/мин, с набором «Сорб-ГМО-А»– 7 тыс. об/мин.

Таким образом, нуклеиновые кислоты, выделенные методом с применением набора «Сорб-ГМО-А» будут подвергаться меньшему термическому и механическому воздействию.

В методе фенольной экстракции для выделения ДНК на стадии отмывания и преципитации использовали химический способ – растворители. Во втором и третьем случае с применением наборов «ПРОБА‒ЦТАБ» и «Сорб-ГМО-А» использовали сорбент в виде эмульсии.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика чистоты выделенной ДНК. Степень чистоты выделения дезоксирибонуклеиновых кислот определяли высокочувствительным, простым в исполнении спектрофотометрическим методом, основанном на поглощении монохроматического потока световой энергии при прохождении его через исследуемый раствор [6].

Таблица 2

Сравнительная характеристика чистоты выделенной ДНК

Метод выделения ДНК	Объект исследования	Чистота ДНК при А260/280	Концентрация выделенной ДНК, мг/г
1	2	3	4
с дополнительной экстракцией фенолом	Смесь 0,1% земляники и банана	1,78	0,38
	Смесь 0,1% малины и киви	1,79	0,36
	Смесь 0,1% вишни и малины	1,78	0,36
	Смесь 0,1% шиповника и вишни	1,79	0,38
	Смесь 0,1% крыжовника и киви	1,80	0,36
	Смесь 0,1% малины и шиповника	1,78	0,36
«ПРОБА– ЦТАБ»	Смесь 0,1% земляники и банана	1,94	0,41
	Смесь 0,1% малины и киви	1,97	0,39
	Смесь 0,1% вишни и малины	2,01	0,39
	Смесь 0,1% шиповника и вишни	1,99	0,38
	Смесь 0,1% крыжовника и киви	2,03	0,40
	Смесь 0,1% малины и шиповника	1,99	0,42
«Сорб-ГМО-А»	Смесь 0,1% земляники и банана	1,97	0,42
	Смесь 0,1% малины и киви	1,99	0,42
	Смесь 0,1% вишни и малины	1,94	0,43
	Смесь 0,1% шиповника и вишни	1,97	0,43
	Смесь 0,1% крыжовника и киви	2,02	0,44
	Смесь 0,1% малины и шиповника	2,00	0,43
с дополнительной экстракцией фенолом	Повидло малиновое, 100%	1,77	0,35
	Повидло земляничное, 100%	1,76	0,36
	Повидло из крыжовника, 100%	1,76	0,35
	Повидло вишневое, 100%	1,76	0,35
	Повидло банановое, 100%	1,76	0,35
	Повидло из киви, 100%	1,76	0,35
	Повидло из шиповника, 100%	1,76	0,36
«ΠPOƂA– ЦТАБ»	Повидло малиновое, 100%	1,98	0,39
	Повидло земляничное, 100%	1,99	0,39

Продолжение табл. 1

1	2	3	4
	Повидло из крыжовника, 100%	1,98	0,40
	Повидло вишневое, 100%	1,98	0,38
	Повидло банановое, 100%	2,01	0,39
	Повидло из киви, 100%	1,98	0,38
	Повидло из шиповника, 100%	2,00	0,39
«Сорб-ГМО-А»	Повидло малиновое, 100%	1,97	0,43
	Повидло земляничное, 100%	1,98	0,45
	Повидло из крыжовника, 100%	1,97	0,44
	Повидло вишневое, 100%	1,95	0,42
	Повидло банановое, 100%	1,94	0,43
	Повидло из киви, 100%	1,97	0,44
	Повидло из шиповника, 100%	1,97	0,43

Анализ экспериментальных данных, представленных в таблице 2, указывает на то, что чистота ДНК при А 260/280 нм всех категорий фруктово-ягодных смесей при выделении ДНК первым методом с дополнительной экстракцией фенолом составляет от 1,76 до 1,80; вторым и третьим с применением наборов «ПРОБА– ЦТАБ» и «Сорб-ГМО-А» - от 1,94 до 2,03. При этом концентрация выделенной ДНК составляет при экстракции первым методом от 0,35 до 0,38 мг/г продукта, вторым – от 0,38 до 0,42 мг/г продукта, третьим – от 0,42 до 0,45 мг/г.

Таким образом, проведенные исследования показали возможность использования выбранных методик выделения нуклеиновых кис- лот из плодово-ягодных объектов. Общий анализ экспериментальных данных позволил определить наиболее эффективный способ экстракции ДНК. В ходе сравнительного анализа установлено, что для экстракции ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов, приготовленных на его основе, наиболее пригоден набор реагентов «Сорб-ГМО-А». Описанный подход дает возможность получить дезоксирибонуклеиновую кислоту надлежащего качества и чистоты.