Исследование митогенетических сигнальных путей в клетке у онкологических больных с помощью программного комплекса Oncofinder

¹Введение. Как исследователи, так и клиницисты-практики неоднократно отмечали в последние годы, что назначение таргетных препаратов (таких, как моноклональные антитела — мабы, или ингибиторы киназ — нибы) онкологическим пациентам по неполным данным об уровне экспрессии отдельных белков-онкогенов может оказаться неэффективным из-за неучета большого количества других онкогенов и онкосупрессоров, которые могут нейтрализовать терапевтическое действие назначенного препарата [1–3]. С другой стороны, в настоящее время в практике научно-клинических исследований утвердились различные методы исследования совокупности матричной РНК (транскриптома) в клетках [4–9], которые позволяют получить информацию об относительном по сравнению с нормой уровне экспрессии многих тысяч генов у индивидуальных онкологических больных.

Результаты такого обследования мРНК могут быть обработаны путем расчета [10–12] количественных показателей патологических изменений в про- и антимитотических сигнальных путях у каждого пациента, что может позволить прогнозировать способность таргетных противоопухолевых препаратов компенсировать эти изменения и останавливать клеточную пролиферацию.

Цель работы : создание и апробация методов, алгоритмов и программного обеспечения для решения данной задачи.

Материал и методы. Объектом исследования являлись патологические изменения в про- и анти-митотических сигнальных путях у онкологических больных, а также способности противоопухолевых препаратов компенсировать эти изменения и подавлять клеточную пролиферацию. Исходными данными, которые могут быть использованы для оценки этих изменений, являются результаты микрочипового обследования транскриптома биоптата как злокачественных опухолей индивидуальных пациентов, так и аналогичных нормальных органов и тканей.

Нами разработан программный комплекс OncoFinder, который при математической обработке использует следующее допущение: для каждого из белков-переносчиков сигнала в каскаде уровень экспрессии в состоянии покоя является много меньшим, чем в состоянии активации (т.е. в состоянии покоя имеет место глубоконенасыщенное состояние каждого из белков-переносчиков сигнала).

Таким образом, система OncoFinder рассматривает белки-переносчики сигнала в каждом сигнальном пути как имеющие потенциально равные возможности вызывать активацию/ингибирование путей. В рамках таких предположений на основе закона действующих масс может быть предложена следующая оценка патологических изменений в сигнальном пути (signal outcome, SO ):

Тел. +79032187261

SO=

N

П[ AGEL ], i=1___________________

M

П[ RGEL1, j=1

В данной формуле умножение производится по всем присутствующим в пути генам-активаторам и ингибиторам сигнала. Величины [ AGEL ] _i (activator gene expression level) и [ RGEL ] _j (repressor gene expression level) — суть уровни экспрессии гена-активатора № i и № j соответственно. Проведем логарифмирование для перехода от мультипликативной величины к аддитивной относительной митогенетической значимости каскада ( pathway mitogenic strength ), служащей для оценки степени патологических изменений в сигнальном пути:

PMSp = £ ARRnp• BTiFn • 1g (CNRn)

n

Здесь CNRn (cancer (case) — to-normal ratio) есть отношение уровней экспрессии гена, кодирующего белок n, у конкретного больного к норме (среднему значению у контрольной группы). Дискретная величина BTIF (beyond tolerance interval flag) вычисляется как:

BTIF=

О, значение CNRn в пределах доверительного интервала

• 1,    значение CNR_n вне пределов доверительного интервала

Дискретная величина ARR ( activator/repressor role ) определяется следующим образом и помещается в базу данных митогенетических путей:

ARR np

• -1; белок n - репрессор сигнала b пути p

• -0,5; белок n ^- скорее репрессор сигнала b пути p

0; нельзя сказать, что белок n ^- репрессор или активатор сигнала b пути p

0,5; белок n - скорее активатор сигнала n пути p

1; белок n ^- активатор сигнала b пути p

Базы данных системы OncoFinder содержат следующую информацию:

– имена генов согласно международной номенклатуре и их роли ( ARR ) в активации сигнальных путей;

– названия узлов графов (диаграмм) взаимодействия белков в сигнальных путях, имена входящих в эти узлы генов, а также стрелки, показывающие взаимодействия (связывания, активацию, ингибирование) между ними — на основании данных портала SABiosciences компании Qiagen [13];

– информация о таргетных противоопухолевых препаратах (белки и гены-«мишени»), показания, противопоказания и др.

Для апробации программного комплекса OncoFinder мы использовали наборы данных по ре- зультатам экспрессии генов у онкологических больных, а также в нормальных тканях, депонированные в свободном доступе на интернет-портале Gene Expression Omnibus (GEO) [14]. Для каждого из наборов данных, содержащих результаты обследования многих пациентов, мы анализировали средние значения вычисленных с помощью программы OncoFinder величин, а также их стандартные отклонения.

Результаты.

Анализ влияния локализации и типа онкологического заболевания на митогенетические пути в клетке. С помощью программного комплекса OncoFinder для восьми онко- и гематологических нозологических форм проведен сравнительный анализ различий в патологических изменениях в 80 про- и антимитотических сигнальных путях. Процент сигнальных путей, для которых различие между средними значениями PMS патологических изменений в уровнях экспрессии генов-переносчиков сигнала превышает сумму стандартных отклонений для этой пары сигнальных путей, показан в табл. 1.

Верификация способности программного комплекса OncoFinder предсказывать клиническую эффективность противоопухолевых препаратов. Для предклинической верификации системы проведено сравнение результатов ее применения для больных, у которых была ранее проверена клиническая эффективность применения противоопухолевого препарата трастузумаба (герцептина) для двух наборов [15–16] образцов биоптатов рака молочной железы. Анализу подлежали два предложенных нами способа предсказания клинической эффективности препарата. Одна из величин, обозначенная нами как Drug Score 1 (DS1), оценивает способность препарата компенсировать патологические изменения в про- и антимитотических сигнальных путях в злокачественных клетках. Другая, названная нами Drug Score 2 (DS2), оценивает способность препарата снижать митотическую (пролиферативную) активность злокачественных клеток. Результаты проверки сведены в табл. 2. Видна корреляция между более высокими значениями величин DS1 и DS2, с одной стороны, и большей клинической эффективностью трастузумаба, хотя диапазоны статистической неопределенности (стандартного отклонения) для этих величин частично перекрываются.

• 4.    Обсуждение.

Проверка устойчивости (робастности) формулы для оценки патологических измерений в сигнальных путях. В расчетах величины PMS программа OncoFinder полагает одинаковую важность всех генов для активации митогенетических путей,

Таблица 1

Процент сигнальных путей, для которых различие между средними логарифмическими значениями патологических изменений в уровнях экспрессии генов-переносчиков сигнала превышает сумму стандартных отклонений для этой пары сигнальных путей

	Астроцитома (n=13)	Рак мочевого пузыря (n=63)	Различ — ные опухоли мозга (n=9)	Хрони — ческий лимфо-лейкоз (n=10)	Различные опухоли головы и шеи (n=42)	Немелко-кле-точный рак легкого (n=40)	Рак почки (n=58)	Рак кожи (n=9)
Астроцитома	0	18	14	8	18	29	20	30
Рак мочевого пузыря	18	0	0	0	24	6	0	9
Различные опухоли мозга	14	0	0	3	5	48	4	4
Хронический лимфолейкоз	8	0	3	0	3	4	1	8
Различные опухоли головы и шеи	18	24	5	3	0	50	26	5
Немелкоклеточный рак легкого	29	6	48	4	50	0	48	60
Рак почки	20	0	4	1	26	48	0	10
Рак кожи	30	9	4	8	5	60	10	0

Таблица 2

Сравнение двух предиктивных показателей, DS1 и DS2, для клинической эффективности препарата трастузумаба (герцептина). Указаны средние значения и стандартные отклонения этих показателей

Изученные параметры

Число больных со значимыми клиническими улучшениями

Число больных без значимых клинических улучшений

DS1 для больных со значимыми клиническими улучшениями

DS1 для больных без значимых клинических улучшений

DS2 для больных со значимыми клиническими улучшениями

DS2 для больных без значимых клинических улучшений

Количество больных и вариационно-статистические показатели
Набор №42822 [15]	Набор № 37946 [16]
12	27
11	21
210 ± 140	360 ± 150
110 ± 80	320 ± 110
15 ± 3	13 ± 4
10 ± 6	12 ± 5

Таблица 3.

Сигнальные пути больных колоректальным раком, наиболее измененные по истечении шести недель после лучевой терапии в 50 Гр (статистика по девяти больным)

Сигнальный путь Характер изменений Степень изменений Cellular anti-apoptosis Активация Очень сильная Mitochondrial apoptosis Ингибирование (различие более трех стандартных отклонений) Androgen receptor Активация cAMP Активация CREB Активация Estrogen Активация IP3 Активация Сильная (различие более двух стандартных отклонений) JNK Активация MAPK Signaling Активация PPAR Активация TGF beta2 Активация что в большинстве практических случаев не вполне соответствует действительности. Мы провели стохастическую проверку данной гипотезы следующим образом. В расчетах для величины PMS встречается суммирование по генам логарифмов

• < FTC ^

lg ( CNRn ) = lg [v где ELCn — уровень экспрессии гена n у индивидуального ракового больного, а ELNn — средний уровень экспрессии того же гена в норме у той же популяции. Во время этой проверки мы случайным образом возмущали (проведя 100 независимых испытаний) относительную важность каждого из генов для каждого из сигнальных путей с помощью логнормально распределенных весовых факторов wn, каждый из которых вычисляли как wn = 2^n , где ξn — нормально распределенные случайные числа с математическим ожиданием M=0 и стандартным отклонением σ=0.5. Результаты такого стохастического теста показаны на рисунке.

Видно, что даже значительное возмущение весовых коэффициентов значимости генов для сигнальных путей не в состоянии замаскировать пропорциональность среднего значения возмущенных PMS от невозмущенных.

Проверка влияния лучевой терапии на митогенетические сигнальные пути. Действие не только таргетных противоопухолевых препаратов, но и, к примеру, ионизирующих излучений также изменяет активность многих клеточно-физиологических процессов. В частности, выживание клеток после облучения находится в прямой зависимости от активации репарации ДНК, а также ингибирования проапоптотических и пронекротических реакций [17]. Нами исследовано влияние лучевой терапии на митогенетические сигнальные пути для девяти пациентов с колоректальным раком, облученных в суммарной дозе 50 Гр за 20 фракций. По истечении шести недель после лучевой терапии, облученную опухоль удаляли хирургически, а уровни экспрессии различных генов исследовали с помощью установки ABI Human Genome Survey Microarray [18]. С помощью программного комплекса OncoFinder мы проанализи- ровали влияние лучевой терапии на про- и антимито-тические сигнальные пути. Наибольшую активацию лучевая терапия для данных больных оказывала, как и ожидалось, на антиапоптозные пути, наибольшее ингибирование — на апоптозные, значительно усиленными оказываются также гормональные пути и каскады семейства митогенактивированных проте-инкиназ, которые тоже можно рассматривать как положительные «таргеты» лучевой терапии.

Заключение. Нами предложен новый способ оценки патологических изменений в сигнальных путях у онкологических больных, а также способности противоопухолевых препаратов компенсировать эти изменения и останавливать клеточную пролиферацию. Данный метод, основанный на математической обработке результатов микрочипового исследования мРНК (транскриптома) биоптата опухолей, реализован в виде программного комплекса OncoFinder. Показана способность программы OncoFinder определять сигнальные пути — маркеры некоторых локализаций и типов онкологических заболеваний, продемонстрирована положительная корреляция между оцененной с помощью данной программы способности снижать активность митогенетических путей и улучшением в клиническом состоянии больных, подтверждено свойство лучевой терапии активировать промитотические, в особенности антиапоптозные, пути и ингибировать проапоптозные.