Исследование морфологических изменений тканей внутренних органов лабораторных животных при воздействии нанодисперсных оксидов переходных и легких металлов и неметаллов

Автор: Землянова Марина Александровна, Игнатова Анна Михайловна

Журнал: Вестник Пермского университета. Серия: Биология @vestnik-psu-bio

Рубрика: Экология

Статья в выпуске: 3, 2019 года.

Бесплатный доступ

Проведено исследование морфологических изменений тканей внутренних органов у мышей линии BALB/C при пероральном введении суспензий нанодисперсных оксидов алюминия, кобальта, марганца и кремния. Расчет доз для ежедневного введения животным опытной группы осуществляли с учетом установленной ранее LD50 для каждого вещества. В результате исследования установлено, что характерными морфологическими изменениями при воздействии нанодисперсных частиц оксидов переходных металлов (марганца и кобальта) являются изменения в тканях тимуса, при воздействии оксидов легких металлов (алюминия) - ткани костного мозга, оксидов неметаллов (кремния) - ткани надпочечников. Наибольшие морфологические изменения в тканях легких при воздействии исследуемых наноразмерных частиц наблюдаются при воздействии оксидов переходных металлов (марганца и кобальта).

Еще

Наночастицы, оксид алюминия, оксид кобальта, оксид марганца, оксид кремния, морфологические изменения в тканях

Короткий адрес: https://sciup.org/147227095

IDR: 147227095   |   DOI: 10.17072/1994-9952-2019-3-320

Текст научной статьи Исследование морфологических изменений тканей внутренних органов лабораторных животных при воздействии нанодисперсных оксидов переходных и легких металлов и неметаллов

за 2007 - 2017 гг. количество изобретений в области синтеза новых наноразмерных частиц ежегодно увеличивается на 5 - 7%. Среди всех изобретений в области использования нано-дисперсных материалов, доля относящихся к медицине составляет порядка 23%. При этом в общей доле инноваций, количество разработок с оксидными нанодисперсными частицами составляет 38%. Доля инноваций в области химических технологий, предполагающих применение нано-дисперсных материалов за анализируемый период возрастает стабильными темпами на 3% в год, доля использования оксидных наноразмерных частиц – от 9 до 18%.

По данным международных баз цитирования количество индексируемых англоязычных и русскоязычных публикаций по результатам исследований в области нанотоксикологии за последние 6 лет составило порядка 3 120 и 986 публикаций соответственно.

В совокупности результаты патентного поиска и анализа баз цитирования подтверждают тенденцию активного темпа развития и внедрения нано-дисперсных материалов, опережающего изучения последствий воздействия данных материалов на организм человека и окружающую среду [Трифонова, Ширкин, 2009; О концепции…, 2011; Развитие системы…, 2013; Хмельницкий, Ларин, Лучи-нин, 2015].

За последние 10 лет накоплен значительный опыт в области нанотоксикологии по вопросу воздействия оксидных наноразмерных частиц. При этом анализ данных системы цитирования показал, что доля исследований, проводимых in vitro, значительно больше по сравнению с исследованиями in vivo [Богатырев, 2014; Характеристика регуляторных…, 2014; Хайруллин, Самарин, 2014]. В работах ряда авторов показано, что исследования, проведённые на клеточном материале, не позволяют выявить характерные морфологические изменения тканей внутренних органов, что недостаточно для всесторонней оценки негативного эффекта воздействия нанодисперсного вещества [Руководство …, 2010; Землянова, Акафьева, 2014].

Таким образом, исследования комплексного характера, проводимые зарубежными исследователями [Genotoxicity induced…, 2018; Direct evidence…, 2018; Response of…, 2018; Cellular alterations…, 2019], позволяющие в сравнении наблюдать эффекты различных нанодисперсных веществ, остаются актуальными на сегодняшний день.

Целью настоящего исследования является сравнительное изучение морфологических изменений тканей внутренних органов (сердце, легкие, печень, селезенка, желудок, почки, тонкий и толстый кишечник, костный мозг, тимус, семенники, надпочечники, головной мозг) при воздействии нано-дисперсных оксидов лёгких и переходных металлов и неметаллов.

Материал и методы исследования

Материал

Для проведения исследований по оценке воздействия переходных металлов использовали порошок нанодисперсного оксида кобальта (рег. номер CAS 1308-06-1, размер частиц 20–50 нм) и оксида марганца (рег. номер CAS 313-13-09, размер частиц 34–39 нм); для оценки воздействия легких металлов – порошок нанодисперсного оксида алюминия (рег. номер CAS 1344-28-1, размер частиц 13–20 нм); для оценки воздействия неметаллов – порошок нанодисперсного оксида кремния (рег. номер CAS 7631-86-9, размер частиц 25–35 нм).

Для получения рабочей суспензии исследуемых веществ в качестве растворителя использовали би-дистиллированную воду (ТУ 6-09-2502-77). Для равномерного распределения частиц в объеме суспензии проводили ультразвуковую обработку на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopuls Hd 3200 (Bandelin, Германия) при комнатной температуре в течение 15 мин. в режиме непрерывной пульсации на 80%-ной мощности.

В качестве экспериментальных животных использовали самцов белых мышей линии BALB/C массой 15–30 г.

Методы исследования

Эксперименты с лабораторными животными выполнены в соответствии с требованиями методических указаний (МУ 1.2.2520-09) «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» методом Лима [A method for…, 1961], этического комитета ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных [Guide for the care…, 2011]. Животные на протяжении всего эксперимента содержались в условиях лабораторного вивария (по 4 особи в полипропиленовых клетках стандартного размера Т/3) на по-лусинтетическом рационе. Доступ к корму и питью не ограничивали. Температура в помещениях в период наблюдения составляла 23.0±2.0ºC, влажность воздуха – 60.0±5.0%.

При оценке каждого нанодисперсного вещества рандомизация животных выполнена на четыре опытные группы и одну контрольную группу по 12 особей в каждой. Всего в исследовании использовано 60 особей. Животным опытных групп ежедневно однократно в объеме 0.2 мл вводили водные суспензии исследуемых веществ при помощи металлического атравматического зонда (ГОСТ 32296-2013) в течение 14 сут. Контрольная группа получала бидистиллированную воду без веществ в эквивалентном объёме. Расчет доз для ежедневного введения животным опытной группы осуществляли с учетом установленной ранее LD50 для каждого вещества (CoO =2000 мг/кг, MnO = 2340 мг/кг, Al2O3 = 2000 мг/кг, SiO2 = 4638 мг/кг).

Введение веществ осуществляли по схеме: в первые 4 дня ежедневно вводили дозу, равную 1/10 LD50, затем каждые последующие 4 дня дозу увеличивали в 1.5 раза. У животных после выведения из эксперимента методом декапитации извлекали висцеральные органы (сердце, легкие, печень, селезенка, желудок, почки, тонкий и толстый кишечник, костный мозг, тимус, семенники, надпочечники, головной мозг).

Отобранные образцы фиксировали в 10%-ном забуференном нейтральном формалине. Дегидратацию фиксированных кусочков тканей в спиртах и инфильтрацию в парафине проводили в автоматическом гистологическом процессоре «Excelsior ES» (Thermo Scientific, Германия). Далее фрагменты заливали гомогенизированной парафиновой средой «Histomix» на станции заливки блоков модульного типа «Histo Star» (Thermo Scientific, Германия). Для получения гистологических препаратов изготавливали парафиновые срезы (3–4 микрона) на санном микротоме «Microm HM 450» (Thermo Scientific, Германия), которые окрашивали по общепринятой методике гематоксилином и эозином в роботе-окрашивателе «Varistain Gemini ES» (Thermo Scientific, Германия). Заключение покровными стеклами выполняли аппаратом «Clearvue ES» (Thermo Scientific, Германия). Полученные микропрепараты исследовали на светооптическом микроскопе Axio Lab A1 (Carl Zeiss, Германия), микрофотографии выполняли на светооптическом микроскопе MEIJI (Япония) с установленной камерой microscopy VISION (Канада) при увеличении х 100, х 200, х 400. Анализ изображений был проведен с помощью программного обеспечения ImageJ-FiJi.

Для сравнительной оценки тяжести морфологических изменений тканей легких были определены: фрактальная размерность альвеолярного рисунка и коэффициент сферичности альвеолярных пространств. Коэффициент сферичности определяет близость формы элемента альвеолярного пространства к идеальной сфере. Для этого были отобраны наиболее показательные изображения тканей легких животных опытных и контрольной групп. Предварительно эти изображения были обработаны методами бинаризации и скелетониза-ции.

Оценку статистической значимости различий между групповыми показателями проводили мето- дом определения F-критерия Фишера при заданном уровне значимости (р≤0.05).

Результаты и их обсуждение

Результаты и их обсуждение

Количественная сравнительная оценка тяжести морфологических изменений в тканях легких проведена по показателям фрактальной размерности альвеолярного рисунка и коэффициента сферичности альвеолярных пространств [Зайцева и др., 2018]. Пример исходных изображений, использованных для оценки количественных показателей, представлен на рис. 1.

На рис. 2 представлена графическая зависимость, демонстрирующая фрактальную размерность альвеолярного рисунка легких у животных контрольной и опытных групп. В таблице представлены численные характеристики коэффициен- та сферичности альвеолярных пространств и показателя фрактальной размерности.

Показатели фрактальной размерности и коэффициента сферичности альвеолярного рисунка всех опытных групп достоверно отличаются от показателя контроля (р = 0.0001-0.012). При воздействии наноразмерных частиц оксида кобальта и марганца величина фрактальной размерности в 1.2 раза меньше, чем аналогичный показатель в контроле (F3.3= 5.1; F4.8= 11.7; p = 0.007-0.012). При воздействии наноразмерных частиц оксида кобальта, марганца, алюминия и кремния величина коэффициента сферичности превысила в 1.3-2.2 раза аналогичный показатель в контрольной груп- пе (p = 0.0001-0.0054).

а

б

в                           г

Рис. 1 . Ткани легких животных опытных групп при воздействии нанодисперсных частиц:

а – оксида кобальта (окр. г-э, ×100), б – оксида марганца (окр. г-э, ×200), в – оксида алюминия (окр. г-э, ×100), г – оксида кремния (окр. г-э, ×100)

Таким образом, сравнительное исследование морфологических изменений тканей внутренних органов самцов мышей линии BALB/C при воздействии нанодисперсных оксидов лёгких и переходных металлов и неметаллов показало, что воздействие нанодисперсных частиц оксидов переходных и легких металлов и неметаллов приводит к морфологическим изменениям тканей легких, селезенки и тонкого кишечника. Характерными при воздействии нанодисперсных частиц оксидов переходных металлов являются изменения в тканях тимуса, при воздействии оксидов легких металлов

Размер элементов, log

Рис. 2. Зависимости, характеризующие фрактальную размерность альвеолярного рисунка легких мышей:

  • 1    – контрольная группа и многократное воздействие оксидных наноразмерных частиц: 2 –оксид кобальта, 3 – оксид марганца, 4 – оксид алюминия, 5 – оксид кремния

Характеристика фрактальной размерности альвеолярного рисунка и коэффициента сферичности альвеолярных пространств тканей легких самцов мышей линии BALB/C при воздействии нанодисперсных оксидов кобальта, марганца, алюминия и кремния

Показатель

Контрольная группа

Нанодисперсные частицы

Оксиды переходных металлов

Оксид легкого металла (оксид алюминия)

Оксид неметалла (оксид кремния)

Оксид кобальта

Оксид марганца

Фрактальная размерность альвеолярного рисунка, D (M±m)

1.750±0.001

1.418±0.001* (F 3.3 =5.1; p=0.012)

1.398±0.001* (F 4.8 =11.7; p=0.007)

1.670±0.001* (F 6.2 =10.5; p=0.001)

1.541±0.001* (F 5.1 =12.8; p=0.006)

Коэффициент сферичности альвеолярных пространств, k сф (M±m)

0.30±0.02

0.67±0.04* (F 1.2 =1.4; p=0.0004)

0.57±0.03* (F 1.4 =3.0; p=0.0001)

0.41±0.05* (F 1.2 =1.8; p=0.0012)

0.52±0.04* (F 1.6 =1.9; p=0.0054)

* достоверное отличие от контрольной группы.

Наибольшие морфологические изменения в тканях легких при воздействии исследуемых нано-размерных частиц наблюдаются при воздействии оксидов переходных металлов (марганца и кобальта).

Список литературы Исследование морфологических изменений тканей внутренних органов лабораторных животных при воздействии нанодисперсных оксидов переходных и легких металлов и неметаллов

  • Богатырев В.А. Лабораторная диагностическая система токсичности наноматериалов // Известия высших учебных заведений. Прикладная нелинейная динамика. 2014. № 6. С. 3-14.
  • Зайцева Н.В., Землянова М.А., Акафьева Т.И. Негативные эффекты наночастиц оксида марганца при ингаляционном поступлении в организм // Экология человека. 2013. № 11. С. 25-29.
  • Зайцева Н.В. и др. Морфологические изменения тканей легких мышей при воздействии наноразмерных частиц оксида никеля // Российские нанотехнологии. 2018. Т. 13, № 7-8. C. 44-50.
  • Землянова М.А., Акафьева Т.И. Оценка кумулятивного действия нанодисперсного диоксида кремния в эксперименте in vivo // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2014. Вып. 4. С. 101-104.
  • Макаров Д.В. Конкурентоспособность нанотехнологической индустрии Российской Федерации как сегмента мирового рынка нанотехнологий // Вестник КРАУНЦ. Физико-математические науки. 2012. № 2. С. 74-79.
  • О концепции обеспечения единства измерений, стандартизации, оценки соответствия и безопасности использования нанотехнологий, наноматериалов и продукции наноиндустрии в Российской Федерации до 2015 года / Элькин Г.И. и др. // Метрологическое обеспечение нанотехнологий и продукции наноиндустрии. М.: Логос, 2011. C. 132-146.
  • Развитие системы оценки безопасности и контроля наноматериалов и нанотехнологий в Российской Федерации / Онищенко Г.Г. и др. // Гигиена и санитария. 2013. № 1. С. 4-11.
  • Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под ред. Н.Н. Карпищенко, С.В. Грачева. М.: Профиль-2С, 2010. 358 с.
  • Трифонова Т.А., Ширкин Л.А. Экологическая безопасность наночастиц, наноматериалов и нанотехнологий: учеб. пособие. Владимир: Изд-во Владимир. гос. ун-та, 2009. 64 с.
  • Фролов Д.П., Лаврентьева А.В., Полынцев И.Д. Институциональные проблемы развития наноиндустрии: мировой и Российский опыт // Национальные интересы: приоритеты и безопасность. 2016. Т. 12, № 3 (336). С. 79-92.
  • Фролов Д.П., Рыжкин В.В. Дискуссионные вопросы политики регулирования российской наноиндустрии // Вестник Волгоградского государственного университета. Сер. 3: Экономика. Экология. 2015. № 1. С. 50-59.
  • Хайруллин Р.З., Самарин Е.В. Особенности обеспечения безопасных условий труда работников предприятий наноиндустрии // Вестник Казанского технологического университета. 2014. № 15. С. 331-333.
  • Характеристика регуляторных систем у детей при воздействии химических факторов среды обитания / Ланин Д.В. и др. // Гигиена и санитария. 2014. № 2. С. 23-26.
  • Хмельницкий И.К., Ларин А.В., Лучинин В.В. Современное состояние нормативно-методического обеспечения безопасности нанотехнологий в Российской Федерации // Биотехносфера. 2015. № 5(41). C. 95-103.
  • A method for the evaluation of cumulation and tolerance by the determination of acute and subchronic median effective doses / Lim R.K. at al. // Archives internationales de pharmacodynamie et de thérapie. 1961. № 130. P. 336-353.
  • Cellular alterations in midgut cells of honey bee workers (Apis millefera L.) exposed to sublethal concentrations of CdO or PbO nanoparticles or their binary mixture / Dabour K. et al. // Science of the Total Environment. 2019. Vol. 651 (Pt. 1). Р. 1356-1367.
  • Direct evidence for surface long-lived superoxide radicals photo-generated in TiO2 and other metal oxide suspensions / Wang D. et al. // Physical Chemistry Chemical Physics. 2018. Vol. 20, № 28. Р. 18978-18985.
  • Genotoxicity induced by metal oxide nanoparticles: a weight of evidence study and effect of particle surface and electronic properties / Golbamaki A. et al. // Nanotoxicology. 2018. Vol. 12, № 10. Р. 1113-1129.
  • Guide for the care and use of laboratory animals / National Research Council of the national academies. Washington: The national academies press, 2011. 248 p.
  • Response of the antioxidant enzymes of rats following oral administration of metal-oxide nanoparticles (Al2O3, CuO, TiO2) / Canli E.G. et al. // Environmental science and pollution research international. 2019. Vol. 26, № 1. P. 938-945.
Еще
Статья научная