Исследование острой токсичности аэрозоля нанодисперсного оксида марганца для прогнозирования опасности здоровью работающих и населения при ингаляционной экспозиции

Наноразмерные частицы оксида марганца – перспективный наноматериал для создания высокотехнологичных компонентов, используемых в современных отраслях отечественной промышленности – наноэлектронике, нанооптике, нанохимии. В связи с этим в последнее десятилетие отмечается активный рост производства и потребления продукции, использующей в качестве одного из компонентов нано-дисперсный оксид марганца. Данное вещество широко применяется при производстве полу- проводниковых термисторов [1], солнечных батарей, различных электроприборов, катодных катализаторов, наномагнитных и сорбирующих материалов [2]. Специфичной и перспективной областью применения является создания сенсорных электродов и биосенсоров, для которых могут быть использованы нитевидные частицы оксида марганца [3].

Результаты исследований Hussan, Stefanes-cu, Frick [4–6] позволяют предположить, что в определенных условиях наночастицы оксида

марганца при их ингаляционном поступлении в организм могут вызывать негативные последствия для здоровья, в том числе токсического характера. Имеются данные об усилении после 24-часовой экспозиции каталитической генерации активных форм кислорода (АФК) в альвеолярных эпителиальных клетках человека [6]. Обнаружено увеличение уровня на 30 и 80 % внеклеточной и внутриклеточной окисленной формы глутатина (GSSG) соответственно [4]. Elder et al. и Oberdorster [7, 8] описывают условия, при которых наночастицы оксида марганца размером до 30 нм проявляют способность проникать по обонятельному нерву в нейроноподобные клетки PC-12 головного мозга, а также накапливаться в астроцитах, других клетках головного мозга [8, 9]. В экспериментах исследователи наблюдали незначительное угнетение митохондриальной деятельности с дозозависимым снижением содержания дофамина и его метаболитов: дигидроксифенилуксусной кислоты и гомованилиновой кислоты. Показано, что установленным явлениям сопутствуют значительное увеличение АФК [5, 10], нейродегенератив-ные нарушения уже через 2–3 недели экспозиции [7, 8], активация протеолитического расщепления, опосредованного каспазой-3 и проте-инкиназой Сδ (ферментами, участвующими в процессах апоптоза, некроза и воспалительных процессах). Показана и активация цикла фосфорилирования [10–13]. Crittenden и Filipov [14] описали, что рост концентрации частиц наноксида марганца вызывает линейное увеличение уровня p38 мутагенактивной проте-инкиназы. Последняя, в свою очередь, является пусковым механизмом апоптоза, преждевременной клеточной гибели. Elder et al. [7] указали на факты, свидетельствующие о том, что при воздействии вещества в среднем мозге и полосатом теле, в обонятельной луковице и лобной коре вдвое усиливается экспрессия гена фактора некроза опухоли-α. Установлено, что длительная ингаляционная экспозиция наночастиц оксида марганца формирует активацию белка трансферрина в дофаминергических нервных клетках. Выявлены также структурные изменения в белках Beclin 1 и LC3, что, в свою очередь, может указывать на потенциальную активацию процесса аутофагии [5].

В связи с этим для массового и эффективного внедрения перспективных технологий использования наноразмерного оксида марганца в промышленном производстве вопросы обеспечения безопасности работающих и населения являются актуальным. При этом особую значимость приобретает задача изучения параметров токсичности аэрозоля нанодисперсного оксида марганца при ингаляционном поступлении в организм [15].

Материалы и методы. Эксперимент проводили на водной суспензии нанодисперсного оксида марганца, синтезированной прямым взаимодействием ионов Mn²⁺ и MnO 4 с применением мицелл цетилтриметиламмония бромида (СТАВ, C 16 H 33 (CH 3 ) 3 NBr) как нанореакторов [16]. Навеску СТАВ растворяли в спирте при комнатной температуре в течение 30 минут при интенсивном перемешивании (CTAB/EtOH = 1:10). В спиртовый раствор CTAB добавляли водный раствор 0,4 М MnSO 4 ⋅ 5H 2 O. Смесь постоянно перемешивали в течение 24 часов и по каплям медленно вводили в нее 0,05 М водный раствор KMnO₄. Полученную смесь еще в течение суток перемешивали до завершения реакции. Темно-коричневый осадок промывали дистиллированной водой. Цетилтриметиламмония бромид удаляли экстракцией этанолом. Степень экстракции – не менее 98 %. Остаточную концентрацию цетилтриметиламмония бромида после экстракции определяли методом хромато-масс-спектрометрии с тандемным детектором Agilent. Матриксом суспензии являлась бидистиллированная вода, соответствующая ТУ 6-09-2502-77¹.

Размер и форму частиц оксида марганца в водной суспензии оценивали методом динамического лазерного светорассеяния на анализаторе Horiba LB-550 (Horiba, Япония) (отдел химико-аналитических методов исследования ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения), методом электронной микроскопии на сканирующем микроскопе высокого разрешения (3–10 нм, максимальное увеличение 300000Х) S-3400N (HITACHI, Япония) с приставкой для рентгеновского энергодисперсионного микроанализа (Bruker, Германия) (кафедра химической технологии ФГБОУ ВО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»).

Текстурные параметры определяли сорбцией азота при температуре -196 ° С на приборе ASAP 2020 (Micromeritics, США) после дегазации исследуемого материала в вакууме в течение 3 часов. Удельную площадь поверхности образцов ( S BET ) рассчитывали по методу, предложенному Брунауэром, Эмметом и Тейлором [17]. Общий объем пор ( Vtot ) рассчитывали из количества азота, адсорбированного при относительном давлении р / р 0 ≈ 0,99. Распределение пор по размерам определяли по изотермам десорбции, используя метод Баррета, Джойнера и Халенды [18]. Структуру образца исследовали методом рентгенофазового анализа на дифрактометре XRD-7000, Shimadzu, в условиях Cu _{K a} -излучения в интервале углов 2а = 1-8 ° .

Массовую концентрацию оксида марганца в суспензии определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (приборное обеспечение – Agilent 7500cx с окто-польной реакционной/столкновительной ячейкой). Газ-реактант – гелий. Перед выполнением измерений с помощью ультразвукового гомогенизатора Sonopuls Hd 3200, фирма Bandelin, проводили диспергирование вещества с целью разрушения агрегатов и агломератов, возможно, образовавшихся в результате старения образца. Равномерного распределения частиц в объеме добивались непрерывной пульсацией в течение 2 минут при комнатной температуре.

Оценку острой токсичности нанодисперс-ного оксида марганца при ингаляционном поступлении в виде аэрозоля проводили в порядке, установленном ГОСТ 32646-20142. Острый эксперимент осуществляли на половозрелых крысах самцах и самках линии Wistar с массой тела 190 ± 10 г. Все животные содержались по две особи в клетках стандартного размера из полипропилена. До начала эксперимента был выдержан 14-дневный карантин. Виварий был оборудован вентиляцией, температура воздуха поддерживалась на уровне 23,0 ± 2,0 °C, влажность – на уровне 60,0 ± 5,0 %. Животные были обеспечены полноценным полусинтети-ческим рационом питания. Доступ к пище и воде не ограничивали. Все исследования и процедуры строго соответствовали принципам и стандартам Европейской конвенции по защите позвоночных животных3, что контролировалось этическим комитетом научного центра, на базе которого проводились исследования.

Ингаляционное поступления наноксида марганца обеспечивали в ингаляционной системе с камерой для всего тела типа TSE Systems GmbH и интегрированным программным модулем. Предотвращение заглатывания частиц примеси с поверхности тела достигалось размещением экспериментальных животных специальных индивидуальных домиках. Экспериментальные животные составили две опытные группы, в каждой их которых было по три самки и три самца. Ингаляционная экспозиция первой опытной группы составила 4 часа при концентрации оксида марганца 0,05 мг/дм³; второй группы также 4 часа, но при концентрации примеси на уровне 0,5 мг/дм³. Приток и отток воздуха в ингаляционную камеру осуществляли со скоростью 10 л/мин. Скорость подачи суспензии в генератор аэрозоля составила 0,014 мл/мин и 0,17 мл/мин соответственно. Это позволяло создать в камере равномерную циркуляцию вещества. Давление внутри камеры поддерживалось на уровне – 0,2 ± 0,2 миллибара. Температуру обеспечивали порядка 22-25 ° С. Уровень содержания кислорода в камере составлял около 19 %, углекислого газа – не более 1 %.

Реально создаваемую концентрацию оксида марганца в ингаляционной камере оценивали методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Agilent 7500cx. Отбор проб воздуха проводили со скоростью 0,5 л/мин в течение 5 минут через 2 и 4 часа экспозиции на фильтр АФА-ВГ-10-1 со скоростью 2 л/мин в течение 5 минут. Определение количества наночастиц в камере (концентрации) выполнено с использованием диффузионного аэрозольного спектрометра, произведенного ООО «АэроНаноТех» (Россия).

Корма во время экспозиции экспериментальные животные не получали.

По завершении экспозиции за животными наблюдали в течение четырех дней, принимая во внимание эффекты возможной отложенной токсичности. Класс опасности по критерию средней смертельной концентрации вещества

(CL 50 ) определяли по показателям гибели животных с применением алгоритма, представленного в ГОСТ 32646-2014¹, а также в соответствии с ГОСТ 12.1.007.76⁴.

Результаты и их обсуждение. Исследование суспензии образца в концентрации 36,0 ± ± 2,3 мг/мл с остаточным содержанием CTAB в суспензии ниже порога определения (0,00001 мг/мл) показало, что распределение частиц по размеру, соответствующего размеру поперечного сечения, имеет следующий вид: 13 нм (1,2 % от общего количества частиц), 15–29 нм (94,3 % от общего количества частиц), 33–87 нм (4,1 % от общего количества частиц). Наибольшая доля в суспензии приходится на частицы размером 19 ± 4 нм (41,2 % от общего количество) (табл. 1).

По результатам сканирующей электронной микроскопии установлено, что визуализируемые частицы (частицы более 20 нм) в основном имеют нитевидную форму (97,8 % от общего количества видимых частиц).

Изотерма адсорбции – десорбции азота соответствует IV типу (изотерма с четко выраженной капиллярной конденсацией). Форма петли гистерезиса принадлежит к Н3-типу с выраженной областью заполнения мезопор в интервале относительных давлений ( р/р 0 ) 0,7–1,0. Заполнение мезопор в области более высоких относительных давлений подтверждает присутствие мезопор крупного диаметра (рис. 2). Удельная площадь поверхности частиц нанодисперсного оксида марганца составила 150,23 м²/г, общий объем пор – 0,676 см³/г. По данным рентгенофазового анализа установлено отсутствие упорядоченной структуры мезопор (рис. 3).

Рис. 1. Изображение частиц нанодисперсного оксида марганца методом сканирующей электронной микроскопии

Рис. 2. Изотерма адсорбции – десорбции азота ( а ) и распределение пор по размерам d (нм) ( б ) нанодисперсного оксида марганца

Таблица 1

Дисперсность наночастиц оксида марганца в водной суспензии

Размер частиц в суспензии, мкм	Доля частиц, %	Размер частиц в суспензии, мкм	Доля частиц, %
0,0131	1,2	0,0387	0,38
0,0150	9,6	0,0443	0,64
0,0171	16,4	0,0507	0,90
0,0196	20,0	0,0581	0,73
0,0225	21,2	0,0666	0,42
0,0257	13,9	0,0762	0,39
0,0295	13,2	0,0873	0,15
0,0338	0,44

Рис. 3. Рентгенограмма нанодисперсного оксида марганца

Данные по физическим параметрам наночастиц оксида марганца, синтезированных методом темплатного синтеза, соответствовали характеристикам, требуемым для создания сенсорных электродов [3], и корректного моделирования острой ингаляционной экспозиции.

Данные аналитических измерений свидетельствовали, что при задаваемой концентрации оксида марганца 0,05 мг/л в ингаляционной камере формируется фактическая концентрация на уровне 0,029 ± 0,001 мг/дм3, при задаваемой концентрации 0,6 мг/л – 0,472 ± 0,005 мг/л. Результаты измерения количества наночастиц в воздухе камеры показали, что при подаче в камеру нанодисперсная фракция, переходя в аэрозоль, не агломерирует до микрометрового диапазона (табл. 2). Наибольшее количество частиц при исследованных фактических концентрациях через 2 и 4 часа экспозиции не превышало размерности 100 нм.

Клиническая картина эффектов на начальном этапе острой интоксикации аэрозолем на-нодисперсного оксида марганца в фактической концентрации 0,029 ± 0,001 мг/л характеризовалась появлением у всех животных чихания, кашля, прозрачных отделений из носа, что свидетельствовало о раздражением дыхательных путей. С третьего по четвертый час экспозиции у животных регистрировали учащенное дыхание, отдышку. При этом исследователи регистрировали у животных участие в акте дыхания вспомогательной мускулатуры, вынужденную позу (выгибание спины, наклон головы и т.п.). С четвертого часа экспозиции у животных отмечали развитие угнетенного состояния с симптомами заторможенности, отсутствием реакции на звуковые раздражители, нарушением координации движения. В течение 24 часов после экспозиции у экспериментальных животных фиксировали дрожь тела, отсутствие двигательной активности, крайне слабую реакцию на звуковые раздражители, отказ от корма и воды. Через 72 часа после ингаляционного воздействия признаков угнетенного состояния не наблюдалось, животные поедали корм. Однако отмечено, что двигательная активность и реакция на звуковые раздражители были снижена. Гибели животных в эксперименте за период 96 часов наблюдения не зарегистрировано.

Клиническая картина интоксикации животных в условиях воздействия аэрозоля нанодис-персного оксида марганца в фактической концентрации 0,472 ± 0,005 мг/л была несколько иной. Так, дыхательная недостаточность была отмечена уже с 30-й минуты экспозиции, Через 3 часа были отмечены угнетение дыхания и гибель животных. Зафиксировано, что перед принятием бокового положения животные были заторможены, реакция на звуковые раздражители и двигательная активность отсутствовали. 83 % экспонированных животных гибли в период 150–190 минут от начала эксперимента (табл. 3).

Таблица 2

Результаты исследований концентрации и размера частиц нанодисперсного оксида марганца в воздухе ингаляционной камеры

Показатель	Исходный уровень	Через 2 часа экспозиции	Через 4 часа экспозиции
Концентрация оксида марганца, мг/дм3	0,002	0,456	0,472
Концентрация частиц при 0–20 нм, ед./дм3	63	10421	9980
Концентрация частиц при 20–40 нм, ед./дм3	48	35 930	31 207
Концентрация частиц при 40–60 нм, ед./дм3	42	35 602	36 783
Концентрация частиц при 60–80 нм, ед./дм3	22	26 370	25 809
Концентрация частиц при 80–100 нм, ед./дм3	8	17 783	14 320

Таблица 3

Динамика гибели экспериментальных животных при исследовании острой ингаляционной токсичности аэрозоля водной суспензии нанодисперсного оксида марганца

Группа животных	Фактическая концентрация, мг/л	Число животных в группе, абс.	Сроки наблюдения в сутках (часах)				Число погибших животных
			1 (1)	2 (2)	3 (3)	4 (6)	абс.	%
№ 1	0,029 ± 0,001	6	0/6	0/6	0/6	0/6	0	0
№ 2	0,472 ± 0,005	6	0/6	0/6	5/6	6/6	6	100

В соответствии с процедурой оценки параметры острой ингаляционной токсичности CL50 исследованного нанодисперсного оксида марганца приняли на уровне 120 мг/м3. Данная концентрация укладывается в диапазон 50–500 мг/м3, что позволяет отнести исследуемое вещество – наноразмерный оксид марганца – к веществам 2-го класса опасности по Международной системе классификации и маркировки химических веществ (GHS) и к веществам 1-го класса опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007.763.

В процессе производства сенсорных электродов и аккумуляторных батарей применение в качестве активной матрицы нитевидных частиц нанодисперсного оксида марганца рассматривается как высокоперспективное направление. Применение вещества обусловливает его вероятное появление в воздухе рабочей зоны и дальнейшее распространение на прилегающие территории. Это определяет опасность ингаляционной экспозиции работников, занятых на производстве, и населения селитебных территорий.

Полученные в рамках исследования результаты свидетельствуют о способности исследуемых наноразмерных частиц оксида марганца вызывать негативные эффекты: раздражающий, нейротоксический, угнетение дыхания, сочетание которых могло обусловить гибель животных.

Наличие токсического эффекта вещества в отношении клеток нервной системы, развития негативных нейропсихологических эффектов при низкодозовом воздействии доказано как для наночастиц оксида марганца, так и для его микродисперсного аналога [10, 12, 19]. В основе нейротоксического механизма действия может лежать нарушение функций мембран нейронов в результате перекисного окисления мембранных липидов, вызванного прямым цитотоксическим действием наночастиц, установленным для дофаминэргических нейронов [10, 12, 20]. Данный эффект у нанодисперсных частиц может быть более выраженным по сравне- нию с действием микродисперсного аналога в связи с большей удельной площадью поверхности нанодисперсных частиц. Клиническая картина острой интоксикации подтверждает описанный механизм токсического действия нанодисперсных частиц оксида марганца в ранее проведенных исследованиях [21]. Развитие дыхательной недостаточности может быть связано с потенциальной возможностью исследуемых наночастиц вызывать воспалительные изменения с последующим апоптозом альвеолярных эпителиоцитов. При этом, обладая большей резистентностью к мукоцилиарному удалению, наноразмерные частицы оксида марганца более длительно контактируют с клетками дыхательных путей по сравнению с микро-дисперсным аналогом [22]. По величине CL50, равной 120 мг/м3, нанодисперсный оксид марганца относится к веществам 2-го класса опасности в соответствии с Международной классификацией опасности химических соединений [23] и к веществам 1-го класса опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007.763.

Выводы. Нанодисперсный оксид марганца с размером сечения частиц нитевидной формы преимущественно 13–29 нм обладает острой токсичностью при ингаляционном поступлении в виде аэрозоля. CL 50 при 4-часовой экспозиции для крыс линии Wistar составляет 120 мг/м³. Клиническая картина острой ингаляционной экспозиции характеризуется раздражающим, нейротоксическим эффектами действия, угнетением дыхания. Нейротоксический эффект сохраняется у выживших экспериментальных животных через 92 часа после экспозиции. Таким образом, можно отнести нанодисперсный оксид марганца ко 2-му классу опасности (по критерию CL 50 ) в соответствии с Международной классификацией опасности химических соединений (GHS) и к 1-му классу опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007.76³.