Исследование предсердного натрийуретического пептида при артериальной гипертензии разного генеза в эксперименте

Введение. Предсердный натрийуретический пептид (ПНП) является одним из биологически активных веществ, участвующих в регуляции гемодинамики. ПНП оказывает гипотензивный эффект за счет диуретического и натрийуретического действия через почки и угнетения ренин- ангиотензин-альдостероновой системы [1, 2]. С момента начала исследований считалось, что ПНП выбрасывается в ответ на растяжение стенки сердца и/или увеличения объема кровотока. Дальнейшие экспериментальные работы показали, что накопление и выведение пептида запускается в ответ на целый ряд разнообразных факторов, детальные молекулярные механизмы которых активно исследуются и до конца не ясны [2, 3].

В клинике выявлены показатели содержания ПНП в плазме крови в норме и при сердечно - сосудистой патологии, сопровождающейся повышенным артериальным давлением (АД). Как правило, неблагоприятным фактором является высокая плазменная концентрация пептида [1, 4, 5, 6]. До сих пор не удается объяснить так называемый «гормональный парадокс», при котором большое количество ПНП на фоне повышенного АД не оказывает гипотензивного эффекта [7, 8, 9].

Исследователями выдвинута точка зрения о неоднозначности действия ПНП и об участии пептида в патогенезе сердечно – сосудистых заболеваний, сопровождающихся повышенным АД [1, 2, 7, 10]. Экспериментально показано увеличение продукции ПНП в миоцитах правого предсердия до появления признаков наследственной гипертензии [7]. В то же время выявлено участие ПНП в процессах ремоделирования миокарда при хронической сердечной недостаточности в виде угнетения пролиферации и синтетической активности фибробластов и антигипертрофиче-ского влияния на кардиомиоциты (КМЦ) [2, 3, 11].

Недостаток сведений о роли ПНП в возникновении и развитии артериальной гипертензии при различных сердечно-сосудистых заболеваниях свидетельствует об актуальности исследований в данном направлении.

Цель исследования – изучить процессы накопления и выведения предсердного натрийуретического пептида (ПНП) в гранулах кардиомиоцитов в условиях гипертензии разного генеза у крыс.

Материал и методы исследования. Экспериментальное исследование проводили на 22-х белых аутбредных Wistar крысах-самцах, массой

220-250г. Все исследования на животных были выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1984); «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (принятой 18.03.1986г. и подтвержденной 15.06.2006г.); «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза СССР от 13.11.1984г. №724).

Были использованы две экспериментальные модели: артериальную гипертензию наблюдали через 60 суток постреперфузионного периода (ПРП) после 10-минутной тотальной ишемии по В.Г. Корпачевуи др. [12] и через 30 суток после перевязки левой почечной артерии по А.Х. Когану [13], при развившейся вазоренальной гипертензии (ВГ). Измерение артериального давления (АД) осуществляли под эфирным наркозом неинвазивным методом с помощью прибора LE5001 Non Invasive Blood Pressure Meter (Panlab, Испания).

Анализировались 3-и группы животных: интактные крысы (n=7), животные через 60 суток ПРП (n=7) и крысы с ВГ (n=8).

Электронно-микроскопический анализ образцов ткани правого предсердия (ПП) и левого желудочка (ЛЖ) проводили по стандартной методике [14]. Иммуноцитохимические реакции для выявления локализации ПНП осуществляли на ультратонких срезах с помощью поликлональных антител Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (128) (rat) (ф. Peninsula Laboratories, LLC, Bachem, США), и антител Protein-A/Gold (15 nm) (ф. EM Grade, Electron Microscopy Sciences, США). Срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца и анализировали в электронном микроскопе Morgagni 268D (ф. FEI, США). По одной из используемых классификаций, выделили два типа гранул: А-тип, «зрелые, запасающие» и В-тип, «растворяющиеся» [15, 16]. А и В гранулы с пептидом в предсердных КМЦ считали по методике в полях зрения (38х38 мкм2) [17, 18]. На электронных микрофотографиях с увеличением х14000 с помощью программы AnalySIS проводили морфометрический анализ площадей митохондрий (Мх), миофибрилл (Мф), саркоплазматического ретикулума (СПР) и саркоплазмы КМЦ ПП и ЛЖ.

Исследование ткани ЛЖ на светооптическом уровне проводилось у интактных крыс, через 60 суток ПРП и животных с ВГ. Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин [19]. Приготовленные на микротоме SM 2000R (Leica, Австрия) срезы 5 – 7 мкм, окрашивали по Ван Гизону (для выявления коллагеновых волокон); изучали с помощью светового микроскопа Eclips 80i (Nikon,

Япония) и программы NIS-Elements BR 4.00.02. При увеличении х40 определяли диаметр КМЦ, процентное соотношение КМЦ (участки, окрашенные в желто-зеленый цвет) и компонентов соединительной ткани (коллагеновых волокон, окрашенных красным цветом, и неокрашенные участки внеклеточного матрикса) в полях зрения 2560х1920 мкм. Результаты оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение. Морфометрический анализ гранул с ПНП - иммунореактивным материалом выявил следующее: показатели в группе животных с ВГ практически не отличались от интактных, за исключением количества гранул В – типа, которое снизилось на 39% от исходного. В группе гипертензивных крыс через 60 суток ПРП наблюдалось, наоборот, увеличение продукции ПНП: количество гранул А – типа было на 60%, В – типа на 41%, общего количества на 53% достоверно больше интактных животных (рис. 1).

В обеих группах артериальное давление было повышено: у крыс с ВГ на 28%, а у животных через 60 сут ПРП на 23% (т.е. практически сопоставимые величины). При этом в группах наблюдалась разная морфологическая картина.

Интересно отметить, в обоих случаях выявлена гипертрофия кардиомиоцитов: в группе животных с ВГ увеличение поперечного сечения КМЦ на 54%, у гипертензивных крыс через 60 суток ПРП на 23% относительно показателей интактных животных. Гипертрофия КМЦ у животных с ВГ не сопровождалась увеличением соединительнотканных компонентов в интерстициальном пространстве, в отличие от крыс через 60 суток ПРП, в миокарде которых отмечались фибробласты в активной форме, увеличение волокон зрелого коллагена на 2% и внеклеточного матрикса на 12% (рис. 2а, б). По-видимому, гипертрофический фактор влиял на увеличение накопления и выведения ПНП в совокупности с другими факторами, такими, как факторы роста фибробластов и т. д [2, 3, 11].

У животных через 60 суток ПРП морфологические изменения в ПП и ЛЖ указывали на процессы ремоделирования. Исследователями установлено, при ремоделировании миокарда образуется порочный круг: гипертрофия, усиление сердечного выброса, повышение напряжения трения на стенку центральных и периферических сосудов, активация ростовых факторов, активизация атеросклеротического процесса, повышение выработки вазоконстрикторных факторов, рост периферического сопротивления сосудов, рост АД по центральным и сосудистым механизмам, повышение нагрузки на миокард, дальнейшее увеличение гипертрофии [20]. К этому порочному кругу следует добавить гипоксию, которая возни-

Рис. 1. Количественное распределение гранул с ПНП в условиях отдаленного постреперфузионного периода и при вазоренальной гипертензии (по тесту Манна-Уитни).

кает вследствие нарушения контакта с капиллярами из-за увеличения площади соединительной ткани в периваскулярном пространстве.

Авторами показано, через 60 суток ПРП в стенке артерий наблюдалась повышенная активность перекисного окисления липидов. Гипертензия при этом сопровождалась отсутствием реакции расслабления в ответ на введение ацетилхолина, которая объяснялась увеличением относительной массы коллагеновых волокон, нарушением эластических свойств сосуда и межклеточных взаимодействий эндотелия и гладкомышечных клеток [21]. В ответ на низкую реактивность сосудов в отдаленном ПРП могла увеличиться продукция ПНП в ПП.

У крыс с ВГ не было выявлено пролиферативной и синтетической активности фибробластов, показанное авторами [22]. Можно сказать, наблюдалась тенденция к такому развитию структурных перестроек в более отдаленный период: количество коллагеновых волокон увеличилось до 2% и внеклеточного матрикса до 3% относительно показателей интактных животных (рис. 2а, в).

На продукцию ПНП в ПП животных с ВГ могла повлиять почечная недостаточность. Авторами показаны выраженные изменения в ультраструктуре ишемизированной и контралатеральной почек при ВГ [23]. Исследователями также выявлено снижение плотности рецепторов к натрийуретическим пептидам типа А (NPR-A) при такой модели гипертензии [2, 10, 24]. Этим объясняется отсутствие гипотензивного эффекта ПНП, несмотря на повышенную экспрессию генов предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в желудочках сердца и содержание пептидов в плазме [22]. ПНП, циркулирующий в кровотоке, вероятно, приводил к увеличению синтеза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в КМЦ, который угнетал продукцию ПНП в ПП [25].

Анализ ультраструктуры выявил следующие различия. Площадь митохондрий ПП в обеих экспериментальных группах не отличалась от интактных животных. В ЛЖ у животных с ВГ площадь митохондрий также не отличалась, а в группе через 60 суток ПРП увеличивалась на 35%, что свидетельствовало о гиперплазии органелл (табл.). В то же время, ультраструктура самих митохондрий в группе с ВГ была более изменена относительно группы через 60 суток ПРП: визуально в половине органелл наблюдалось нарушение крист и образование вакуолей (рис. 3а). В группе с ВГ как в ПП, так и в ЛЖ площадь вакуолей составила 2% от исследуемой площади КМЦ; в группе через 60 суток ПРП в ПП вакуолей не наблюдалось, в ЛЖ они занимали 1% от площади клетки.

В группе с ВГ в ПП площадь элементов СПР не отличалась, а в ЛЖ превышала в 2 раза показатель интактных животных. В группе через 60 суток ПРП СПР был расширен в ПП на 77%, в ЛЖ в 3,5 раза (табл.).

Соотношение компонентов соединительной ткани и кардиомиоцитов в левом желудочке интактных крыс

Соотношение компонентов соединительной ткани и кардиомиоцитов в левом желудочке крыс через 60 сут ПРП

Соотношение компонентов соединительной ткани и кардиомиоцитов в левом желудочке крыс с ВГ

Рис. 2. Процентное соотношение тканевых компонентов левого желудочка интактных животных (А); через 60 суток постреперфузионного периода (Б) и в условиях вазоренальной гипертензии (В).

Таблица.

Количественные показатели ультраструктуры кардиомиоцитов крыс с вазоренальной гипертензией и через 60 суток постреперфузионного периода, мкм2 (М±SD)

Отдел сердца	Показатель	Интактные	60 сут ПРП	ВГ
О О d О Осо ф о. d EZ О О. с	Пл. Мх	6,82±2,14	7,34±1,69	7,51±1,62
	Пл. Мф	15,50±2,79	17,65±2,41*	14,86±2,55
	Пл. СПР	0,31±0,22	0,55±0,36*	0,27±0,30#
	Пл. саркоплазмы	9,77±2,90	6,87±1,56*	9,13±2,61#
	Пл. вакуолей	-	-	0,63±0,81*#
о >S т со ф > ^ о X	Пл. Мх	10,68±3,18	14,39±2,88*	12,13±2,44#
	Пл. Мф	18,08±3,21	15,03±3,32*	15,05±2,90*
	Пл. СПР	0,09±0,07	0,32±0,37*	0,21±0,27*
	Пл. саркоплазмы	3,56±1,04	2,50±1,14*	4,27±1,29#
	Пл. вакуолей	-	0,17±022*	0,74±0,59*#

Примечание: * - различия значений достоверны относительно интактных животных; # - различия значений достоверны относительно животных через 60 сут ПРП (р<0,05)

Рис. 3а.

Рис. 3б.

Рис. 3. Ультраструктура миокарда правого предсердия животных с вазоренальной гипертензией (А) и через 60 суток постреперфузионного периода (Б). Ув. 5600 (А), 4400 (Б).

Интересно отметить, на фоне расширения СПР и появления вакуолей произошли изменения в сократительном аппарате КМЦ. В группе с ВГ площадь миофибрилл в ПП не изменилась, а в ЛЖ уменьшилась на 17%; в группе через 60 суток ПРП в ПП площадь миофибрилл увеличилась на

14%, в ЛЖ уменьшалась на 17% относительно показателей интактных животных (табл.). Уменьшение площади миофибрилл в ЛЖ обеих групп свидетельствовало о дистрофических изменениях в КМЦ. В то же время увеличение площади миофибрилл в ПП крыс через 60 суток ПРП могло быть связано с компенсаторной гипертрофией ультраструктуры в этот период, развивавшейся на фоне увеличения соединительнотканного компонента в ткани миокарда (рис. 3б).

У животных с ВГ деструктивные изменения в ультраструктуре ПП и ЛЖ были более выраженными, чем в группе через 60 суток ПРП. Появление в ПП и ЛЖ вакуолей и вакуолизированных митохондрий свидетельствовало о сниженном синтезе АТФ, что могло повлиять на уменьшение продукции ПНП. В то же время значительно расширенный СПР в ПП крыс через 60 суток ПРП мог способствовать гранулообразованию путем захвата кальция и активации Са2+ - зависимых калиевых каналов SK4 [1].

Таким образом, на накопление и выведение ПНП у животных с ВГ и крыс через 60 суток ПРП влиял не повышенный уровень АД, а совокупность факторов, включающих тканевые перестройки в миокарде (увеличение площади соединительной ткани в межклеточном пространстве, гипертрофия кардиомиоцитов, гипоксия) и изменения в ультраструктуре КМЦ (сохранность мембранных структур, в частности митохондрий).