Исследование реакции клеточной культуры на изменение температуры методом динамической спекл-интерферометрии

Неинвазивные методы диагностики, характеризующиеся быстротой и надежностью предоставляемых данных, как известно, представляют перспективное направление в биологии и медицине. Одним из таких методов является метод регистрации динамики спеклов. Спеклы (англ. speckle – крапинка, пятнышко) – случайная интерференционная картина, которая образуется при взаимной интерференции многих когерентных волн, имеющих случайные сдвиги фаз. Со свойствами неподвижных спеклов можно ознакомиться, например, в работах [2, 7, 12].

Хотя в большинстве случаев спеклы являются нежелательным явлением (существуют различные методики фильтрации спекл-шума), доказано, что они несут информацию об объекте исследования: если есть движение в рассеивающем объекте, то картина спеклов меняется – наблюдается динамика спеклов [12].

В настоящее время биоспеклы успешно применяются для изучения активности различных биологических объектов [1, 3, 8, 10–12, 15, 16, 18, 19]. Одним из наиболее успешных примеров использования биоспеклов является разработка подхода, предложенного впервые в работах [13, 17] и доведенного до практического применения в клинических исследованиях. Метод позволяет по контрасту спеклов оценивать скорость потоков крови на сетчатке глаза и вблизи кожных покровов конечности пациента. На данный момент метод достаточно проработан теоретически и экспериментально [14]. Многочисленные ссылки на работы, посвященные применению спеклов для изучения процессов, происходящих в растениях, семенах и фруктах, можно найти в работе [20].

Ранее были разработаны теория метода и методика проведения экспериментов, позволяющие по регистрации динамики спеклов изучать динамику оптических путей волн (показателя преломления) в тонких биологических объектах [4]. Метод динамической спекл-интерферометрии успешно был применен для исследования метаболической активности трех клеточных культур, зараженных вирусом простого герпеса первого типа [6] и в отсутствие вируса [5]. Также с помощью метода была оценена реакция клеточных культур при изменении температуры. Усреднение данных было проведено по сотням клеток [9].

Целью данной работы является подробное изучение реакции малых участков отдельных клеток и группы клеток на изменение температуры. В данной статье приводятся результаты при изменении температуры от 26 до 37 °С.

Краткая теория метода

В работе [4] представлены теория и методика динамической спекл-интерферометрии для усредненных во времени спеклов. Предполагалось, что когерентный источник света освещает неподвижные точечные рассеивающие центры, располагающиеся в тонком прозрачном диффузоре. Вблизи диффузора располагается тонкий прозрачный биологический объект. Линза с линейным разрешением a_s формирует изображение объекта. Фаза j -й волны изменяется случайным образом из-за изменения оптической длины пути u _j в тонком прозрачном объекте.

Было получено выражение для средней по времени интенсивности (1) и для нормированной временной автокорреляционной функции интенсивности излучения (2):

I( с / ) = I 1 + I 2 e" ^k "  2 cos( к ц + а ), (1)

П 1,2 ⁽ t i , t 2 ) = cos [( x 2) - ( x Дх e 2 " 2 ^{22 12} ,                             (2)

где µ - средняя по области диаметром a_s и времени оптическая разность хода пар волн A u k ; о² - дисперсия A u k , x = k ц , I , , I ₂, a = const, угловые скобки ^ ) означают усреднение по ансамблю объектов, x ₁, x ₂ - значения x в моменты времени t ₁ и t ₂ ; k ₁₁, k ₂₂ - дисперсии величины x в моменты времени t ₁ и t ₂ ; k ₁₂ - временная автокорреляционная функция величины x .

Auk = uj- um ,

Uj = J[j l)-n0] dl,(4)

l J

Um = j[ nm ( 1 ) — n 0 ] dl, lm где nj(l) - показатель преломления вдоль пути j -й волны; n0 - показатель преломления в отсутствие объекта. Интегрирование ведется вдоль пути волны.

Если процесс изменения фаз волн стационарный, то вместо (2) имеем (6):

П(т) = e - k ^{11 + k 11 P 12 (t)} ,                                                    (6)

где ρ ₁₂ (τ) - нормированная автокорреляционная функция разности фаз пар волн, *       - k,,                   ^

т = 1 ₂ - 1 ₁ . Из формулы (6) ясно, что при т > х- n = e , где о _u = — J k ₁₁ .

2π

Отсюда следует, что автокорреляционная функция выходит на постоянный *

уровень η , по значению которого можно найти среднеквадратическое отклонение σ _u величин A u_k от среднего значения. Именно величина a _u была использована нами в качестве параметра, характеризующего активность группы клеток или малого участка в пределах клетки.

Техника и методика эксперимента

Эксперименты проводились на клетках линии Л-41, культивированных на стеклянной подложке. Блок-схема установки представлена на рис. 1. В качестве источника света в установке использовался полупроводниковый лазерный модуль KLM-D 532-20-5 с длиной волны 0,532 мкм. Излучение от модуля попадало на матовый расcеиватель, далее – на стеклянную кювету, внутри которой фиксировали стеклянную подложку со слоем клеток и стеклянный фиксатор в питательном растворе. В опытах использовалась монохромная телекамера типа «Видеоскан» 415/П/К- USB . Камера имела матрицу фотоприемников размером 6,5×4,8 мм, содержащую 780×582 ячеек размером 8,3×8,3 мкм. Частота ввода кадров – до 25 Гц. Время экспонирования телекамеры составляло 9 с. Оптическая система установки находилась в газовом термостате с возможностью изменения температуры. Для контроля температуры в кювете с точностью ±0,1 °С использовали термодатчик DS 1820 ( Dallas Semiconduсtor ). Оптическое увеличение микроскопа равнялось 11.

Запись кадров фильма динамики спеклов в формате . bmp осуществляли с помощью программы Viewer , поставляемой вместе с телекамерой «Видеоскан». Сигналы с телекамеры через USB -порт поступали на ноутбук типа Aspire 3692 WLMi фирмы Acer . Время записи кадров составляло до 3 часов.

Значения коэффициента корреляции двух цифровых изображений η определяли с помощью оригинального программного обеспечения по формуле (7)

η =

m ⋅ n

m - 1 n - 1 ∑∑ [ A i , j i = 0 j = 0

- A ][ В i , j - В ]

m - 1 n - 1

¹   ∑∑ [ A i , j

\ ^{m ⋅ n} i = 0 j = 0      ^,

-

A ]² ⋅

m - 1 n - 1

^ m ⋅ n

i = 0 j = 0

где A _{i , j} – 8-битное цифровое значение интенсивности I на участке размером m×n пикселей в начальный момент времени; B _{i , j} – 8-битное цифровое значение интенсивности I на этом же участке через время τ ; i, j – номера пикселей участков в направлении осей x и y соответственно; A – средняя величина цифрового значения интенсивности I на участке в начальный момент времени; B – средняя величина цифрового значения интенсивности I на участке через время τ .

Дальнейшая обработка данных проводилась в стандартном пакете Microsoft Excel 2010.

Величина σ _u , соответствующая клеткам, определялась по двум зависимостям η(τ) в предположении, что процессы в клетках и в питательном растворе протекают независимо. Первая зависимость соответствовала питательному раствору, вторая -клеткам в питательном растворе.

На рис. 2 показана фотография клеток, полученная в белом свете. По этой фотографии выбирали области, соответствующие малым участкам внутри отдельной клетки, либо область массива клеток для изучения их активности. В частности, для изображения массива клеток был выбран участок, содержащий изображение 120 клеток. Значение σ _u находили для τ =18 с.

На рис. 3 приведены типичные графики зависимости η(τ) для питательного раствора и клеток в питательном растворе, по которым определяли величину σ _u для клеток.

Рис. 1. Блок-схема установки

Рис. 2. Изображение клеток в белом свете

η, отн. ед.

1,000 -го

0,995

0,990

0,985

0,980

о

0,975

0,970

0,965 -Ц-0

п------------1-------------1------------1-------------1------------1------------1------------1------------1-------------1------------1        τ, с

Рис. 3. Зависимости коэффициента корреляции от времени: 1 – питательный раствор, 2 – клетки

Рис. 4. Изменение в распределении величины η при температуре 25,9 °С, обнаруженное по четырем кадрам, записанным через 18 с: а – по первым двум кадрам, б – по последним двум кадрам

Распределения величины η , найденные по двум кадрам, взятым через 18 с, показаны на рис. 4. Значения η находились на участках размером 10×10 пикселей, что соответствует области размером примерно в половину одиночной клетки.

О и , мкм

0,024

0,022

0,020

0,018

0,016

0,014

0,012

0,010

0,008

0,006

0,004

0,002

0,000

Т , °С

26    27    28    29    30    31    32    33    34    35    36    37

Рис. 5. Зависимость вариаций оптической разности хода от температуры внутриклеточных участков одной клетки: 1 - цитоплазма; 2 - край;

3 - центр

° _и , мкм

t , c

Рис. 6. Зависимости вариаций оптической разности хода (■) и температуры (о) от времени

На рис. 5 представлены типичные зависимости величины σ _u для малых участков в пределах изображения одной клетки.

На рис. 6, 7 приведены совмещенные графики зависимостей σ _u и температуры ( T ) от времени для массива из 60 клеток.

σ

u

мкм

0,024

0,022

0,020

0,018

0,016

0,014

0,012

0,010

0,008

0,006

0,004

0,002

0,000

t , с

Рис. 7. Зависимости вариаций оптической разности хода (■) и температуры (о) от времени в пределах одного градуса температуры

Рис. 8. Распределение величины η : 1 (синий) – для питательного раствора; 2 (красный) – для клеток

Рис. 9. Изменение относительной доли участков размером 10×10 пикселей с 26 до 36 ºС: 1 (черный) – для клеток с параметром η в диапазоне от 0,971 до 0,981; 2 (синий) – для клеток с параметром η в диапазоне от 0,985 до 0,986;

3 (красный) – для клеток с параметром η в диапазоне от 0,961 до 0,971

Из рис. 6, 7 следует, что при увеличении температуры наблюдаются значительные флуктуации активности клеток в пространстве и во времени.

Если температуру стабилизировать в течение 30 минут, то активность также стабилизируется (см. рис. 7). Коэффициент корреляции массивов σ _u и Т , приведенных на рис. 7, равен 0,88.

На рис. 8 показана типичная гистограмма при Т = 34,9 °С, характеризующая относительное число участков размером 10×10 пикселей, значение η которых попадает в заданный интервал.

На следующем рис. 9 представлены зависимости, характеризующие изменение относительной доли числа участков, имеющих различную активность.

Из рис. 9 видно, что увеличение доли активных клеток происходит за счет вовлечения неактивной части популяции. Анализ гистограмм показал, что уменьшение значений зависимостей 1 и 3 после 34 °C может быть вызвано увеличением доли клеток, имеющих высокие показатели активности ( η < 0,960, т.е. σ _u > 0,012 мкм).

Выводы

Метод корреляции фрагментов спекловых изображений использован для детального изучения реакции клеток на изменение температуры. В качестве параметра, характеризующего активность малого участка в пределах клетки или группы клеток, использована величина σ _u – среднеквадратическое отклонение разности путей волн.

Показано:

• 1.    При увеличении в течение одного часа температуры в диапазоне от 26 до 37 ºС наблюдается сильный разброс активности участков в пределах одной клетки и для группы клеток в пространстве и во времени.

• 2.    При стабилизации температуры в течение получаса (см. рис. 7) разброс активности существенно уменьшается и появляется хорошая корреляция между изменением температуры и изменением активности.

• 3.    Значительный разброс активности единичных клеток, по-видимому, является следствием несинхронности прохождения клеток по циклу.

• 4.    Данные, полученные в ходе исследования, могут быть использованы для создания приборов контроля биологической активности, в том числе контроля в реальном времени, в ряде разделов медицины и биологии.