Исследование свойств антибиотического комплекса штаммов 194 и К-205 Lactococcus lactis subsp. lactis

Синтез бактериоцинов ‒ наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. На синтез бактериоцинов оказывают влияние условия культивирования продуцента: синтез бактериоцина в большинстве клеток популяции можно индуцировать различными физико-химическими воздействиями: ультрафиолетовыми лучами, мутагенами химической природы, перекисями, ДНК-тропными веществами и другими агентами.

Выделение и изучение бактериоцинов требует применения сложных биохимических и микробиологических методов (химическое экстрагирование с использованием различных сорбентов, хроматография, ультрафильтрация и др.). Поэтому немногим исследователям удается выделить, изучить и идентифицировать антибиотики, синтезируемые молочнокислыми микроорганизмами. Большая часть проводимых в этом направлении работ посвящена описанию антагонистического действия различных видов молочнокислых бактерий без установления природы этого явления. При этом используется общеупотребительный термин «антибиотическая активность» («антибиотические свойства»), под которым подразумевается не только действие специфических антибиотиков, но и других антибиотических веществ, продуцируемых молочнокислыми бактериями. Так, без раскрытия природы антибактериальной активности мезофильных молочнокислых бактерий, описано действие некоторых штаммов L. lactis и Str. cremoris на нежелательную микрофлору в процессе производства кисломолочных продуктов.

Для выделения, очистки бактериоцинов использовали различные методы.

Бактериоцины накапливаются в основном в культуральной жидкости, но часть их связана с клеточной стенкой продуцента. Одним из важнейших условий эффективного извлечения бактериоцина из культуральной жидкости является правильный выбор экстрагента – органического растворителя, который бы избирательно и полно извлекал его как из культуральной жидкости, так и из клеточной стенки. Для этого были проведены исследования по выделению и очистке бактериоцинов, продуцируемых штаммами 194 и К-205 L. lactis subsp. lactis .

Материалы и методы

Изучен ряд растворителей, таких как ацетон, бутанол, метанол в различных сочетаниях и концентрациях в сравнении с известной смесью для выделения низина, содержащей ацетонуксусную кислоту-воду. Экстракцию проводили при 55 ° С в течение 1,5 ч для более полного извлечения бактериоцинов из клеток. Воду, ацетон и уксусную кислоту отгоняли в вакууме для получения концентрированного экстракта. Полученный концентрат анализировали методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и электрофореза на бумаге.

UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-160 1PC UV-Visible Spectrophotometer (Japan).

Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали: на приборе VISION методом MALDI- TOF в режиме положительных ионов. Лазер – азот, 337 nm, матрица – DHB (2,5-ди-гидрокси-бензойной кислоты).

Электрофорез проводился на бумаге Filtrak F-14 при 550 В в течение 120 мин в электролитах с рН 1,7 (30%-ная уксусная кислота) и с рН 2,4 (2н уксусная кислота) в приборе, работающем по принципу влажной камеры Дуррома.

Биоавтографию проводили по методике, предложенной в литературе с использованием в качестве тест-организмов Bac. coagulans 429, Bacillus subtilis АТСС 6633.

Для разделения антибиотического комплекса на фракции и получения хроматографически чистых компонентов культуральные жидкости штаммов 194 (рН 4,1) и К-205 (рН 4,6) центрифугировали для отделения от клеток. Надосадочную жидкость дважды экстрагировали н-бутанолом в соотношении 1:3. Бутанольный концентрат экстрагировали органическими растворителями, не смешивающимися с водой, экстракты объединяли, растворитель отгоняли в вакууме на роторном испарителе до получения маслянистого остатка и таким образом получали одну из фракций (В) бактериоцина штаммов Lactococcus lacti s subsp. lactis 194 и К-205. Клетки экстрагировали ацетоном в вакууме, затем проводили его отгон и растворяли в этаноле.

При добавлении к водному маточнику от экстракции избытка метанола образуется обильный осадок – 17 г с 1 л культуральной жидкости штамма 194 и 11 г – штамма К-205. Таким образом, была получена фракция (Н) бактериоцина из культуральной жидкости штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis . Полученное вещество отделяли на стеклянном фильтре и высушивали в вакуум-эксикаторе в течение суток.

Хроматографическое разделение проводили в системе растворителей: метанол-вода (96:4).

Результаты исследования

Антибиотический комплекс был разделен на три основных биологически активных фракции, различающиеся между собой по величине Rf в ряде систем растворителей при ТСХ на силикагеле, а также по электрофоретической подвижности при электрофорезе на бумаге в различных электролитах.

В системе метанол ‒ вода (96:4) при ТСХ фракция 194-Н имеет Rf=0,4. У штамма К-205 биологически активной являлась только средняя фракция, что подтвердилось наличием зон ингибирования тест-культур.

Рисунок 1 ‒ Процесс разделения антибиотического комплекса на компоненты штамм 194: отпечаток хроматограммы на тест-организм Bacillus subtilis с очищенными верхним и средним компонентами штамма 194 L. Lactis subsp. lactis

Электрофоретическое исследование нижнего компонента, выделенного из культуральной жидкости штамма 194, показало, что она мигрирует к катоду и, таким образом, обладает основными свойствами. Методом препаративного электрофореза на бумаге в электролитах эта фракция была разделена на 2 биологически активных компонента. Один из компонентов 194-Н-А совпадает по электрофоретической подвижности со стандартным образцом низина.

Основной фракцией антибиотического комплекса является фракция 194-Н, полученная из водного раствора после отделения фракции 194- В. Фракция Н получена в виде аморфного порошка кремового цвета, активного в отношении некоторых грамположительных микроорганизмов, включая Bac. coagulans.

Методами экстракции и колоночной хроматографии был препаративно получен основной компонент выделенных бактериоцинов из фракции В.

Изучены спектры их антимикробного действия. Компонент В является низкомолекулярным гидрофильным соединением и обладает широким спектром антимикробного действия (табл.).

Так, верхний компонент бактериоцина из штамма 194 активен в отношении большинства грамположительных микроорганизмов, включая термостойкую Bacillus coagulans 429, грамот-рицательных ‒ Escherichia coli 52 и некоторых простейших грибов ‒ Fuzarium oxysporum и Candida guilliermondii 217.

Таблица

Антимикробный спектр действия двух активных фракций антибиотического комплекса, продуцируемых штаммами 194 и К-205 Lactococcus lactis subsp. Lactis

Тест-организмы	Диаметр зон ингибирования фракций (мм)
	нижний компонент		верхний компонент
	194	К-205	194	К-205
Micrococcus luteus 128	23,0	14,0	25,0	15,0
Bacillus mycoides 32	15,0	13,0	14,0	14,0
Bacillus coagulans 429	12,0	13,0	16,0	13,0
Bacillus subtilis	12,0	12,0	15,0	13,0
Staphylococcus aureus 144	14,0	13,0	14,0	14,0
Escherichia coli 52	14,0	12,0	13,0	12,0
Aspergilus niger 369	12,0	9,0	12,0	9,0
Fuzarium oxysporum	13,0	сл.	12,0	8,0
Candida guallermondii 217	12,0	10,0	13,0	9,0

На рисунках 2, 3 показаны УФ-спектрометрические и масс-спектрометрические данные выделенных бактериоцинов.

Рисунок 2 ‒ УФ-спектр верхнего компонента штамма К-205

(Peak Pick: Wavelength (nm.) 268,00 ‒ Abs. 1,1229; Wavelength (nm.) 216,50 ‒ Abs. 3,3113)

Рисунок 3 ‒ УФ-спектр верхнего компонента штамма 194 (Peak Pick: Wavelength (nm.) 206,80 ‒ Abs. 2,2488)

Вывод

В результате проведенных исследований был подобран ряд растворителей для экстракции антибиотический комплекса, которые были разделены на три основные биологически активные фракции. Проведены масс-спектрометрические и электрофоретические исследования данных компонентов. Изучены спектры их антимикробного действия. Компонент В штамма 194 является низкомолекулярным гидрофильным соединением и обладает широким спектром антимикробного действия. Полученные данные были использованы при идентификации по компьютерной базе данных Berdy. Было выявлено, что подобного вещества среди ранее выделенных не обнаружено. По предварительным данным, бактериоцин 194-В является новым.