Исследование термоустойчивости аскоспор Aspergillus (neosartorya) fischeri в зависимости от концентрации растворимых сухих веществ в яблочном соке

Яблочный сок является основой большого ассортимента соковой продукции. Безопасность и качество консервированной соковой продукции обеспечивается качеством сырья и надлежащими режимами стерилизации и пастеризации [1, 2].

Одним из основных критериев разработки режимов стерилизации консервов является термоустойчивость спор микроорганизмов. На устойчивость спор микроорганизмов в обрабатываемых продуктах влияют различные факторы: кислотность, величина рН, активная влажность продукта, содержание сахаров, содержание растворимых сухих веществ (РСВ), белков и другие факторы [3, 4]. Физико-химический состав соковой продукции из фруктов характеризуется высоким содержанием фруктовых (органических) кислот, сахаров (глюкоза, фруктоза, сахароза), аминокислот. Содержание РСВ в соковой продукции зависит от ее вида.

Термоустойчивость споровой микрофлоры относительно различных концентраций фруктовых кислот в соковой продукции установлена [5] и в настоящее время используется при расчётах режимов тепловой обработки. Однако влияние концентраций РСВ на термоустойчивость спор плесневых грибов в консервированной продукции, в том числе в соковой, изучено мало. Известно, что различные концентрации РСВ влияют на устойчивость вегетативной микрофлоры [6-8]. Данный механизм ингибирования возможен и для споровой микрофлоры, что было исследовано в настоящей работе.

Параметры режимов тепловой обработки консервов (температура и продолжительность) устанавливают на основании расчета выживаемости наиболее термоустойчивых спор микроорганизмов, опасных для здоровья людей, и основных возбудителей порчи данного вида консервов [10]. Требования к содержанию плесневых спорообразующих грибов, наиболее часто являющихся источником заражения готовой соковой продукции [11, 12], установлены в техническом регламенте. Среди тест-культур, используемых для целей разработки режимов тепловой обработки соковой продукции, наиболее часто используют споры плесневых грибов A. niger [13], споры термоустойчивой плесени Byssochlamys fulva [14, 15] и споры A. fischeri [16, 17]. В данном исследовании в качестве тест-культуры выбран штамм A. fischeri .

Гибель популяции клеток и спор микроорганизмов в продукте при нагревании происходит не мгновенно, и если в полулогарифмической

2.303

K = ",--- (lg N о - lg N t ),        (1)

τ где т - продолжительность нагрева; Nо - начальное число спор микроорганизмов в определенном объеме продукта; Nt - число оставшихся жизнеспособных спор микроорганизмов после нагрева в течение определенного времени.

В преобразованном уравнении (1) обозначим фактор 2,303/ K через параметр D t -продолжительность обработки, необходимая для снижения концентрации микроорганизмов на один порядок.

При разработке тепловых параметров стерилизации и пастеризации продуктов находят термоустойчивость спор тест-культуры в исследуемом продукте с целью определения параметров их термоустойчивости D t и z °C, которые характеризуют изменение величины термоустойчивости спор микроорганизмов в зависимости от температуры и времени нагревания [20].

Величину параметра D t рассчитывают на основании экспериментальных данных прогревов спор тест-культуры в продукте в изотермических условиях при различных температурах и временных экспозициях с последующим расчетом величины параметра z .

Содержание общей кислотности яблочного сока обычно составляет 0,3-1,2%, что соответствует величине рН продукта менее 4,0. Величина рН сока, в том числе концентрированного, полученного из большинства сортов яблок, менее 3,8 [17]. Поэтому влияние концентрации растворимых сухих веществ на термоустойчивость спор A. fischeri в разных видах яблочных соков исследовалось при величине рН продукта 3,80.

Цель работы изучить динамику изменения параметров термоустойчивости D и z в зависимости от изменения содержания растворимых сухих веществ в соковой яблочной продукции при величине рН продукта 3,80.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования была выбрана соковая продукция из яблок, выработанная на российских предприятиях, с различным содержанием растворимых сухих веществ: концентрированный сок яблочный (ЯКС) с содержанием растворимых сухих веществ 70% Brix, восстановленный осветленный сок яблочный с содержанием растворимых сухих 11,2% Brix и сок яблочный с мякотью и сахаром, содержащий 16% Brix, массовая доля мякоти в этом соке составляла 18,5%. Образцы яблочного сока соответствовали НТД.

Массовую долю растворимых сухих веществ в образцах соковой продукции определяли на рефрактометре японской фирмы «Atago CO., LTD» по ГОСТ.

Величину рН продукта 3,80 устанавливали путем прямого подкисления или подщелачивания. При этом непосредственно в сок при перемешивании добавляли растворы гидроокиси натрия концентрацией 100 г/дм3 или лимонной кислоты концентрацией 200 г/дм3 до достижения нужной величины рН продукта [22]. Величину рН определяли в продукте потенциометрическим методом с использованием рН метра «HANNA рН 211» (Румыния). Подготовку прибора и измерение величины рН проводили в соответствии с НТД [21]. Суммарная погрешность определения рН этим прибором не более ±0,05 в диапазоне от 2 до 9 единиц при температуре измеряемых образцов и окружающей среды от 15 до 60 °C.

Параметры термоустойчивости спор изучали с использованием музейной культуры микроорганизмов ВНИИТеК штамм A. fischeri W ВКМ G-83. Аскоспоры культуры A. fischeri получали в соответствии с НТД. Споры тест-штамма накапливали в посевах на сусло-агаре на чашках Петри. Чашки с твердой питательной средой инокулировали 2–3 каплями взвеси созревших конидий в стерильной воде. Посевы активно растущей культуры термостатировали 10–14 сут при 30 °C, выдерживали 20 сут при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием образовавшиеся споры смывали с поверхности чашек 10–15 см³ фосфатного буфера с рН 4,0. Затем полученную споровую суспензию для отделения спор от фрагментов мицелия фильтровали через стерильные воронки с ватно-марлевым фильтром.

Термоустойчивость споровой суспензии тест-культуры A. fischeri определяли в растворе 0,1 М фосфатного буфера с рН 4,0. Раствор фосфатного буфера использовался в качестве среды для определения контрольной термоустойчивости выбранного штамма тест-культуры микроорганизма.

Титр споровых суспензий устанавливали высевом соответствующих разведений на твердую питательную среду сусло-агар по НТД как средневзвешенное значение из двух подсчетов последовательных разведений. Полученные споровые суспензии содержали в 1 см3 не менее 108 спор.

Количество образовавшихся спор контролировали микроскопированием нативного препарата с помощью фазово-контрастной микроскопии с применением микроскопа Zeiss с программным обеспечением AxioVision Rel.4.8 и камерой Canon PC 1200. Суспензии содержали преломляющие свет блестящие споры в количестве не менее 95% по отношению к общему числу спор.

Кривые термической инактивации (кривые выживаемости) спор были рассчитаны с помощью коэффициента выживаемости во время прогрева при постоянной температуре. Параметры термоустойчивости спор D T и z в исследуемых средах определяли капиллярным методом и рассчитывали по формулам из кривых выживаемости и термоустойчивости. Существенным моментом, определяющим выбор капиллярного метода, являлась жидкая консистенция исследуемых продуктов [10]. В продукт перед прогревом в капиллярах вносили концентрированную споровую супензию A. fischeri .

Прогрев спор производили по методу Штерна и Проктора в модификации ВНИИКОП [4,10]. Этот метод основан на выявлении присутствия жизнеспособных спор микроорганизмов в нескольких капиллярах (не менее четырех) через определенные промежутки времени прогрева при заданной температуре.

Капилляры представляли собой тонкостенные стеклянные трубки, имеющие внешний диаметр 3 мм и длину 7,5 см. Капилляры со споровыми суспензиями прогревали в водной среде в циркуляционном термостате серии LOIP LT-311 с точностью 0,1 °C.

Содержимое капилляров со спорами в буферном растворе или яблочных соках после прогрева и охлаждения высевали в чашки Петри с сусло-агаром, которые инкубировали при 30ºС в течение 3–5 сут. Подсчет оставшегося после прогревов количества жизнеспособных спор в буферном растворе и в яблочных соках определяли посевом соответствующих разведений на твердую питательную среду сусло-агар.

В каждом капилляре содержалось 0,1 см3 продукта с не менее 1×106 жизнеспособных спор. При этом время теплопроникновения в капилляр для достижения температуры прогрева было принято равным 7 с [10].

Для каждого времени прогрева высевали по четыре капилляра и определяли зависимость остаточной концентрации выживших спор от продолжительности прогревов. Искомую зависимость определяли, представляя ее в полулогарифмической шкале «lg N – продолжительность обработки» с последующей аппроксимацией на основании предположения о линейном виде искомой зависимости:

lg y = 1g ^ о - к т ,            (2)

где N – остаточная концентрация выживших спор микроорганизмов, КОЕ/г; N 0 – концентрация спор микроорганизмов в начальный момент времени, КОЕ/г; τ – продолжительность обработки, мин; k – темп гибели спор микроорганизмов в результате обработки, lg(КОЕ/г) / мин.

В качестве промежуточного параметра термоустойчивости микроорганизмов при температуре обработки Т принимали величину параметра D T , определяемую как продолжительность обработки, необходимую для уменьшения концентрации выживших спор микроорганизмов на один порядок. Формально данный показатель является величиной, обратной k:

D_T = 1/ к.                (3)

В качестве второго параметра термоустойчивости использовали величину z – изменение температуры, необходимое для изменения параметра D T на один порядок. Для этого в полулогарифмических координатах представляли зависимость параметра lg D T от температуры обработки. Данные аппроксимировали линейной функцией методом наименьших квадратов [20]: lgD T = IgD - k D Т ,          (4)

где lg D 0 – значение lg D T при Т = 0; k D – темп изменения lg D T , lg(мин)/ С.

В этом случае параметр z является величиной, обратной от k D (^оС/lg(мин), или – для простоты –^о С):

z = 1/ к..

Кривые термической инактивации спор являются линейными линиями регрессии для коэффициента скорости гибели спор. В программе Microsoft Excel такому уравнению соответствует линия тренда – это графическое представление закономерности изменения ряда данных.

Для определения значений параметра z строили кривую термического отмирания спор, используя значения параметра D T , полученные при четырех температурах прогрева.

Результаты и обсуждение

На основании полученных экспериментальных данных прогревов споровых суспензий в диапазоне температур 80–95 °С для каждой температуры построены зависимости концентрации жизнеспособных спор микроорганизмов от времени обработки различных образцов соковой продукции с различными концентрациями РСВ в изотермических условиях. Обработка экспериментальных данных кинетики гибели микроорганизмов в области определения продолжительности тепловой обработки может быть удовлетворительно аппроксимирована линейной функцией (рисунок 1). Построенные зависимости кинетики гибели спор в изотермических условиях в продуктах с различным содержанием РВС соответствуют кинетике первого порядка с коэффициентом корреляции линейности в диапазоне от 0,93 до 0,98.

На основе кинетики гибели спор A. fischeri (рисунок 1) и расчетов по формулам (1)–(4) определили значения параметров термоустойчивости D T и z (таблица 1).

Таблица 1.

Значения параметров термоустойчивости спор A .fischeri

Table 1.

Thermal stability parameters of A. fischeri spores

РСВ,% Brix	T , о С	Фосфатный буфер Phosphate buffer	Осветленный яблочный сок Clarified Apple juice	Яблочный сок с мякотью Apple juice with pulp	Концентрированный яблочный сок Concentrated Apple juice
	–	1,33	11,2	16,0	70,0
D , мин	80	16,68	22,07	24,75	27,10
	85	4,90	6,81	7,94	8,74
	90	0,42	0,82	0,95	1,33
	95	0,07	0,16	0,23	0,40
z , о С	–	6,06	6,83	7,17	7,92

6,5

(a)

(b)

(c)                                                                  (d)

Рисунок 1. Кинетика гибели спор A. fischeri в процессе тепловой обработки в изотермических условиях, °С: a – 80; b – 85; c – 90; d – 95 для образцов соковой продукции с концентрациями РСВ, %: 1,33; 11,2; 16,0 и 70,0.

Figure 1. Kinetics of A. fischeri spore death during heat treatment under isothermal conditions, °С: a – 80; b – 85; c – 90; d – 95 for samples of juice products with RSV concentrations, %: 1.33; 11.2; 16.0 and 70.0.

На основании полученных данных установлено, что с ростом концентрации растворимых сухих веществ в яблочных соках увеличивается термоустойчивость спор A. fischeri. То есть для достижения одного и того же стерилизующего эффекта (количество порядков концентрации микроорганизмов, на которое происходит ее снижение) требуется бóльшая продолжительность обработки. В силу зависимости показателя DT от температуры обработки в качестве показателя термоустойчивости микроорганизмов используют его значение, соответствующее базисной (реперная) температуре для данного вида микроорганизмов. Основным постулатом существующих подходов в России к разработке или подтверждению режима стерилизации является линейность зависимостей параметров термоустойчивости от температуры и времени, а также использования принципа Вант-Гоффа при расчете динамики летальности на основании кривых прогрева продукта в наименее прогреваемой зоне. Таким образом, для упрощения расчетов, связанных с режимами стерилизации, целесообразно использование некоторого реперного значения температуры, относительно которого затем и определяют изменение летальности.

Как правило, данная температура постулируется в привязке к той или иной группе микроорганизмов и обычно соответствует 121 °С [20]. Для отдельных групп микроорганизмов, обладающих меньшей термоустоустойчивостью, реперная температура может быть ниже. Так, для спор для A. fischeri в яблочных соках она составляет 95 °С.

Поскольку параметры термоустойчивости микроорганизмов и их спор определяются двумя показателями (DT и z), возникает необходимость приведения зависимости каждого из этих показателей к целевому фактору, определяющему отличия одного анализируемого продукта от другого. Для этого нами были определены зависимости D95 и z от концентрации РСВ. В обоих случаях зависимость имела вид:

y = a + b • ln( x), где а, b – коэффициенты; x – концентрация РСВ, %.

Значения коэффициентов и статистические характеристики найденных зависимостей приведены в таблице 2. Сами зависимости

Рисунок 2. Параметры термоустойчивости D и z спор A. fischeri при различных концентрациях сухих веществ (РСВ)

Figure 2. The thermal stability parameters of D and z spores of A. fischeri at various concentrations of solids (RSV)

Для найденных зависимостей критическими являются квадрат коэффициента корреляции, отражающий тесноту их связи с аналитическими данными, и коэффициент b , отражающий угол наклона прямой, то есть чувствительность к величине концентрации РСВ.

В таблице 2 представлены коэффициенты и статистические характеристики параметров z и D 95 по обоим показателям b и R ².

Таблица 2.

Характеристики зависимостей параметров термоустойчивости от концентрации РСВ

Table 2.

Characteristics of the dependences of the parameters of thermal stability on the concentration of RSV

Параметры термоустойчивости Thermal stability parameters	Коэффициенты и статистические характеристики Coefficients and statistical characteristics
	а	b	R 2
D 95	0,0276	0,0794	0,9061
z	5,8630	0,4685	0,9820

Заключение

Установлена динамика коэффициентов параметров термоустойчивости D и z спор плесневого гриба A. fischeri (тест-культуры) от концентрации РСВ соковой продукции. Результаты исследований показали, что с ростом концентрации РСВ растет термоустойчивость спор. Темп нарастания термоустойчивости снижается с увеличением концентрации РСВ.

Поскольку концентрация РСВ влияет на реологические свойства продукции (вязкость), это приводит к изменению кинетики прогрева у продуктов с конвекционным теплообменом, следовательно, рост концентрации РСВ неизбежно должен приводить не только к увеличению термоустойчивости спор микроорганизмов, но и смещению области оптимальных режимов тепловой обработки в сторону увеличения термической нагрузки для обеспечения нормативных требований микробиологической безопасности.