Исследование условий биоконверсии кератинсодержащего сырья живой культурой продуцента

Одним из приоритетных направлений развития сельского хозяйства в России является ускоренное развитие животноводства и птицеводства. Однако высокая себестоимость кормов и недостаток кормового протеина являются теми факторами, которые влияют на рост производства продукции животноводства. В процессе переработки животноводческого сырья образуются отходы или вторичное сырье, из которого можно получить высококачественные корма.

Для исследования биоконверсии кератина в составе питательных сред нами использовались контрольная и модифицированная питательные среды для анализа физиолого-биохимических особенностей продуцента Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 при выращивании в лабораторных условиях в качалочных колбах.

Исследуемые питательные среды были следующего состава, в %: Среда 1                                    Среда 2 Соевая мука            - 2,0      Кератин                  - 2,0 Крахмал картофельный - 7,0      Крахмал картофельный    - 7,0 КН2Р04                 -0,15     КН2Р04                    -0,15 MgS04x7H20           -0,10    MgS04x7H20              - 0,10 FeS04x7H20           - 0,0015    FeS04x7H20              -0,0015 ZnS04                 - 0,0005   ZnS04                   - 0,0005 СаС12                 - 0,005    СаСОз                    -0,400 Положительное влияние на биосинтез кератинрасщепляющих протеаз актиномицетом Streptomyces fradiospiralis ВКМ А- 157 оказывало присутствие в среде некоторых свободных аминокислот. Значительное усиление биосинтеза протеаз происходило в присутствии в среде триптофана. Активность ферментов увеличилась в 2 раза. Полученные результаты подчеркивают целесообразность использования вторичных кератиновых отходов в питательных средах при культивировании актиномицета как индуктора биосинтеза специфических протеаз, возможность их переработки в белковые кормовые продукты методом микробной ферментации. Выращивание вели при 28 °С, исходная величина рН 7,2-7,4. Продолжительность культивирования - 192 часа. Затем культуральную жидкость отделяли от мицелия центрифугированием. Проводили определение рН и ПС в фильтрате культуральной жидкости, редуцирующих веществ и количества биомассы. Первые трое суток определяли данные через 24, в дальнейшем - через 12 часов.

Как видно из таблицы 1., в первые сутки культивирования идет снижение величины рН с 7,4 до 6,0. Затем, к 48 часам, рН быстро поднимается до уровня 7,0. Далее, в течение всего времени культивирования рН стабилизируется на уровне 7,4 - 7,5. Стабилизация рН наблюдается на фоне развивающегося лизиса клеток (96-120 ч) в условиях несменяемой питательной среды и формированием в среде продуктов щелочного характера, как правило, это продукты белкового распада, в том числе мочевина.

Таблица 1.

Динамика роста актиномицета и синтеза протеаз в зависимости от состава питательных сред

Продолжительно сть культивирования, ч	рН фильтрата		Биомасса, г		РВ, мг глюкозы		ПСхЮ3, ед/мл
	номер среды
	1	2	1	2	1	2	1	2
24	6,5	6,0	2,39	1,48	56	43	71	331
48	7Д	7,0	2,77	2,18	63	57	519	1405
72	7,3	7Д	2,90	2,11	78	53	1133	2386
84	7,3	7,2	2,93	2,03	93	48	1502	2663
96	7,3	7,2	2,92	1,99	70	40	1842	2663

108	7,3	7,2	2,86	1,93	59	34	2243	2646
120	7,3	7,3	2,80	1,86	54	27	2520	2632
132	7,4	7,3	2,46	1,78	45	22	2520	2629
144	7,4	7,4	2,14	1,71	39	16	2515	2625
156	7,5	7,4	1,96	1,65	34	И	2512	2623
168	7,5	7,4	1,88	1,57	27	7	2511	2622
192	7,5	7,4	1,80	1,51	22	6	2510	2620

При анализе изменения ПС установлено, что протеолитический комплекс ферментов формируется за счет экзоферментов, максимум образования которых приходится на начало лизиса клеток (84-96 ч) и сохраняется в течение всего процесса практически на одном уровне за счет рН-стабильности в создаваемом диапазоне рН.

Аналогичная картина наблюдается и в случае модифицированной питательной среды, когда вместо соевой муки использовался кератин пера с той лишь разницей, что максимальный биосинтез биомассы и ферментов отмечается на 72-84 ч, т.е. на 24-36 ч процессы протекают интенсивнее, что весьма важно в реализации практических целей. В случае модифицированной среды заметно меньше формируется РВ при выращивании продуцента при практически одном и том же максимуме биомассы, но при значительно большем выходе ПС. Это свидетельствует о значительно большей продуктивности, которая в 1,46 раз выше в случае использования кератиновых отходов, что, по всей видимости, связано как с индуцебельной природой ферментов, так и с лучшими условиями питания при соотношении C:N = 17,5. При этом более 80 % кератиновых отходов переходили в водорастворимые продукты.

Выход биомассы и оценка белков дает положительный ответ на вопрос перспективности их использования в составе кормовых рационов. Однако в случае несменяемой питательной среды не представляется возможным в специальном опыте увеличивать объемы единовременно перерабатываемого кератинсодержащего сырья. Представляло интерес установить целесообразные способы предварительной обработки кератинового сырья для эффективного использования в составе питательных сред. Для этого использовали сведения о физико-химических свойствах входящих в протеолитический комплекс Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 ферментов, а также результаты дополнительно проведенных исследований.

Исследования действия некоторых химических реагентов на протеолитическую активность ферментов показали, что при внесении НО, КОН, NaOH, Na 2 S, СО (NH 2 ) 2 в концентрации 3x10^-2 М в течение 12 ч определенным образом изменяли ПС. При этом такие как НСl инактивировали ПС из-за низкого рН, ПС значительно увеличивалось в случае КОН и NaOH, что связано с щелочным характером используемого комплекса ферментов. Наивысшее значение ПС отмечено в случае мочевины.

Представляло интерес исследовать влияние термических режимов на степень растворения белков используемого сырья. Для этого сырье обрабатывали в различных условиях (табл. 4), охлаждали до оптимальной температуры и вносили ферментный препарат протофрадиоспиралисин Г 10 х в виде водной суспензии при дозировке 6 ед/г белка сырья и вели гидролиз в течение 6 ч.

Как видно из данных таблицы 2, около 70 % белков кератинсодержащего сырья переходит в растворимое состояние при 5-6 часовом воздействии ферментов на предварительно обработанные белки сырья.

Использование предварительно обработанного кератинсодержащего сырья повышает выход биомассы в 3,7 раза, снижает отходы (нерастворимую часть) и обеспечивает более высокую усвояемость продуктов биосинтеза. Режимы наилучшего варианта предварительной обработки сырья с 6

использованием мочевины и автоклавирования максимально сходны с режимами подготовки питательных сред для выращивания микроорганизмов и поэтому не осложняют технологические процессы, не требуют дополнительных капитальных затрат или специального оборудования.

Таблица 2.

Влияние температурных режимов на ферментативный гидролиз кератина пера препаратом протофрадиоспиралисином Г 10х

Варианты предварительной обработки (гидромодуль 1:20)	Растворение белка, % к исходному количеству по часам
	1	2	3	4	5	6
Набухание в воде при 45 °С	0,1	од	0,2	0,2	0,3	0,4
Набухание при 45 °С с добавлением мочевины (0,2 %)	0,3	0,5	0,6	0,8	0,9	0,9
Кипячение с водой	1,3	1,3	1,4	1,6	1,7	1,7
Кипячение с мочевиной (0,2 %)	2,4	2,5	2,7	2,8	2,9	2,9
Автоклавирование с водой (Р=0,15Мпа)	4,2	4,5	4,8	5,3	5,7	6,2
Автоклавирование с мочевиной (0,2 %)	15,5	22,7	42,4	65,8	67,6	69,3

Для увеличения объемов использования кератинсодержащего сырья проводили исследования возможности «подпитки» культуры продуцента в процессе выращивания. Для этого подготовку сред, посев и выращивание вели аналогично описанному выше. Через 48-56 ч (в период максимальной скорости биосинтеза и деления клеток) колбы снимали с качалки и в стерильных условиях добавляли 2 % обработанного кератина и вновь продолжали выращивание в течение 36-42 ч, повторяя операцию 4 раза и доводя объем использования кератинового сырья до 10 %.

В производственных условиях была наработана опытная партия микробной биомассы актиномицета ВКМ А-157, выращенного на среде 2 с кератином пера. Полученная после культивирования биомасса микроорганизма была обработана острым паром при температуре 112 °С в течение 20 минут для полной инактивации ферментов и стерилизации готового продукта.

Эффективность скармливания микробной биомассы была проведена на цыплятах-бройлерах в возрасте от 1 до 56 дней.

В эксперименте предусмотрены две группы бройлеров, отобранных по принципу аналогов по 20 голов в каждой. Птица опытной и контрольной групп рассажена в 3-х ярусной батарее КБХ-3 для содержания бройлеров. Температурный и световой режим для обеих групп находился на одном уровне. Плотность посадки - по 10 голов в клетке.

В рационе кормления было предусмотрено получение бройлерами опытной группы основного рациона - (комбикорм ПК-5-96,5  %, витаминная смесь 0,5 %) и препарата микробной биомассы из расчета 3 % на 100 г поедаемых кормов. Бройлеры контрольной группы получали только основной рацион - (комбикорм ПК-5-96,5 %, сухое молоко 3 %, витаминная смесь 0,5 %).

Питательный состав основного рациона характеризовался следующими показателями:

• 1.    Массовая доля сырого протеина - 20,45 %;

• 2.    Обменная энергия, кДж - 993,0;

• 3.    Массовая доля кальция - 0,86;

• 4.    Массовая доля фосфора - 0,76;

• 5.    Массовая доля натрия - 0,09.

В процессе проведения эксперимента учитывались следующие параметры:  живая масса бройлеров (еженедельное взвешивание), среднесуточный прирост живой массы (1 раз в неделю), сохранность бройлеров (табл. 3) и поедаемость кормов.

Из таблицы видно, что поедаемость кормов в обеих группах была практически одинакова и за период от 1 до 56 дней составила: в опытной -72,4 г, и в контрольной - 72,7 г.

Таблица 3.

Живая масса бройлеров по возрастам

ч ID Н К 1 Н	Среднесуточный привес, г		Живая масса, г		Поедаемость комбикормов, г
	опыт	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль
1	9,3	8,9	103,0	100,0	15,0	13,7
2	19,8	18,0	242,0	226,0	38,4	37,6
3	29,7	22,0	405,0	380,0	56,8	55,0
4	35,7	35,7	700,0	630,0	69,0	68,0
5	39,3	46,6	1030,0	956,0	83,5	85,0
6	46,7	45,4	1350,0	1274,0	93,8	97,4
7	52,0	33,6	1720,0	1610,0	102,8	100,0
8	30,2	20,1	1931,0	1751,0	120,0	125,0

Следует подчеркнуть, что среднесуточный прирост бройлеров был выше в опытной группе и составил 32,8 г, тогда как этот показатель для контрольной группы не превышал 28,8 г. Соответственно, живая масса бройлеров опытной группы в 8-й недельном возрасте находилась на уровне 1931 г, а в контрольной - 1751 г.

Таким образом, кератинсодержащее перо-пуховое сырье возможно перерабатывать методом микробной ферментации в белковые животные корма легкоусвояемой формы. Для повышения выхода микробной биомассы необходимо увеличить массовую долю кератина пера в питательной среде до 10 %. Эффективность использования микробной биомассы в рационах бройлеров подтверждается увеличением их живой массы на 180 г, что составляет 10,3 %. На основании полученных результатов рекомендуется внесение белковых компонентов на основе микробной биомассы в рецептуры комбикормов более 3 %.

Применение биотехнологических методов (применение ферментных препаратов или микробной ферментации) с целью получения белковых животных кормов создает безотходный, экологичный и замкнутый цикл переработки кератиновых отходов по следующей цепочке: живая птица > убой и переработка птицы > вторичные кератиновые отходы > микробная ферментация > белковый корм из биомассы > увеличение живой массы птицы .