Исследование влияния гликозидных соединений стевии на антиоксидантную активность сельскохозяйственных растений

В траве стевии содержится 17 аминокислот (лизин, глицин, метеонин и другие, из них 8 незаменимых); полиненасыщенные жирные кислоты (линолевая, леноленовая, архидоновая); витамин А, витамины группы B, C, E, D, K; флавоноиды; растительные гликозиды, сапонины; алкалоиды; эфирные масла; дубильные вещества; кремневая кислота [4].

Дитерпеноиды представляют собой большой класс природных соединений обмена высших растений. Многие дитерпеноиды являются ценными веществами (регуляторы роста растений, инсектициды, опухолеобразование) [6].

Проведение исследований в области изучения биологической активности вторичных метаболитов растений имеет важное прикладное значение для науки, поскольку на основе веществ, обладающих росторегулирующим действием и антиоксидантной активностью существует возможность создания по-лифункциональных регуляторов роста растений.

Еще японскими исследователями было установлено, что стевиол и его производные обладают свойствами регуляторов роста [7,8].

Известно, что биостимуляторы роста растений, полученные на основе природного сырья являются экологически безопасными и безвредными для человека [2].

Стевиол относили к предшественникам гибберелловой кислоты благодаря характерному для гиббереллинов цис-сочленению В и С колец тетрациклической углеводородной системы. Однако были получены сведения о том, что производные стевиол-гликозидов проявляют гиббереллиноподобную активность [3]. При проведении исследований выяснено, что энткауреновый скелет всех стевиолгликозидов был сформирован подобно гиббериллинам, по метил-эритритолфосфатному пути биосинтеза изопреноидов, разнообразный спектр гликозидов стевии связан с воздействием ферментов гликозилтрансфераз на агликон стевиол [5]. Результатом такого воздействия явилось образование многообразия соединений различной химической структуры.

Так, большой практический интерес представляет изучение антиоксидантной активности гликозидов из листьев стевии, в связи с тем, что имеет большой потенциал в качестве природного источника антиоксидантов.

В настоящее время большинство научных исследований связано, в частности, с тем, что стевия содержит дитерпеновые гликозиды, которые чрезвычайно перспективны в качестве сахарозаменителей для людей, страдающих от нарушений углеводного обмена и, особенно, для больных диабетом, так как они обладают гипогликемическими свойствами [1]. Однако, большой практический интерес представляют дитерпеновые гликозиды, проявляющие самую разнообразную биологическую активность, поэтому ак-тульным является выяснение особенностей действия дитерпеноидов на антиоксидантные системы сельскохозяйственных растений.

Целью данного исследование являлось изучения влияние экстрактов дитерпеновых гликозидов стевии на антиокидантный потенциал озимой пшеницы.

Материалы и методы исследований

Объектами исследования служили сухие листья стевии ( Stevia rebaudiana Bertoni ), из которых извлекали сумму дитерпеновых гликозидов трехкратной водно-спиртовой экстракцией; очистку проводили последовательно фильтрованием и двукратной перекристаллизацией.

Извлечение дитерпеновых гликозидов из листьев стевии с соотношением сырье-экстрагент 1:100 проводили путем экстракции водно-спиртовым раствором при нагревании на кипящей водяной бане в течение 45 мин.

Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) была использована модифицированная методика (Ермаков А.П., 1987), которая основана на изме- рении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода. Объем выделившегося кислорода регистрировали с 3-ей по 15-ю минуту после начала реакции с интервалом 3 мин. По полученным данным строили кинетические кривые зависимости объема выделившегося О2 от времени и аппроксимировали их функцией вида y=a-ln(x)+b.

Активность пероксидазы определяли колориметрическим методом Бояркина с модификациями (Ермаков А.П., 1987). Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования продукта окисления синего цвета определенной концентрации, определяемой заранее методом фотоколориметрии.

Аскорбатпероксидаза (КФ 1.10.3.3) - фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую. Его активность определяли по интенсивности поглощения кислорода спектрофотометрически. Аскорбинова кислота поглощает максимум света при длинне волны 265 нм. Об активности фермента судят по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фермента (Ермаков А.П. 1987).

Определение уровня малонового диальдегида определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, с максимумом поглощения при 532 нм. Молярный коэффициент экстинкции этого комплекса - е = 1,56*10 5 см^-1 *М^-1 (Орехович В.Н. 1997).

Показатели всхожести и энергии прорастания определяли по ГОСТ - 12037. Всхожесть - количество нормально проросших семян, выраженное в процентах к пробе, взятой для анализа. Лабораторная всхожесть определяется после проращивания семян в течение 7-8 суток в термостате в специальных растильнях, заполненных увлажненным прокаленным песком, или чашках Петри, дно которых простилают увлажненной фильтровальной бумагой, при температуре 20-22 °С.

Энергия прорастания - это процент проросших семян з а определенный срок. Показатели энергии прорастания определяли на 4 сутки вегетации.

Результаты и их обсуждение

Проводили исследования по ростостимулирующему влиянию экстрактов дитерпеновых гликозидов на озимую пшеницу сорта « Московская 39». Зерно пшеницы в количестве 100 штук обрабатывали предварительно слабым раствором перманганата калия в течении 30 минут. Затем замачивали исследуемые семена в растворах стевиозида в концентрациях 10⁴%, 10^-6%, 10 ⁸% в течение часа. Семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги согласно ГОСТ в условиях фитотрона. Определяли энергию прорастания на 4-е сутки вегетации, лабораторную всхожесть на 7-е сутки вегетации. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Табли ца 1 - Показатели всхожести и энергии прорастания озимой пшеницы «Мос ковская 39»

Варианты испытаний	Энергия прорастания,%	Всхожесть, %
Контроль (дистиллированная вода)	80	82
Эпин	92	94
Экстракт ДГ,  10-4%	84	86
Экстракт ДГ,  10-6%	84	88
Экстракт ДГ,  10-8%	94	96

По результатам исследования было установлено, что экстракт гликозидов в концентрации 10-8% в большей степени по сравнению с другими исследуемыми вариантами показал оптимальные значения ла- бораторной всхожести и энергии прорастания, морфометрических показателей.

Табли ца 2 - Показатели всхожести и энергии прорастания озимой пшеницы «Мос ковская 39»

Варианты испытаний	Длина корешка, мм	Длина проростка, мм
Контроль (дистиллированная вода)	35	17
Эпин	52	32
Экстракт ДГ,  10-4%	46	22
Экстракт ДГ, 10-6%	48	27
Экстракт ДГ, 10-8%	54	36

Исходя из полученных данных, выявили оптимальную концентрацию экстракта дитерпеноидов 108%: длина корешка составила – 52 мм, длина проростка – 36 мм.

При исследовании биологической активности экстрактов дитерпеноидов, установлено, что экстракт гликозидов концентрации 10-8% в большей степени по сравнению с другими исследуемыми вариантами показал оптимальные значения лабораторной всхожести и энергии прорастания, морфометрических показателей корешков и проростков озимой пшеницы «Московская 39».

Неспецифической реакцией клетки на действие стрессовых факторов является образование активных форм кислорода. Для защиты от активных форм кислорода в растениях выработались системы, включающие в себя как антиоксидантные ферменты, так и низкомолекулярные соединения. Уровень перекисного окисления липидов, в результате которого образуются свободнорадикальные продукты и карбонильные соединения, к которым относится малоновый диальдегид – это важный показатель степени повреждения клетки.

В наших исследованиях наблюдали снижение уровня каталазы (табл.3) в проростках пшеницы, обработанных раствором стевиозида 10-8% на 40% в сравнении с контролем, в том числе наблюдали снижение уровня фермента относительно других ферментов антиоксидантной системы. Данный процесс связан низким сродством к субстрату, и снижение активности каталазы, может быть связано с уменьшением образования активных форм кислорода при действии дитерпеновых гликозидов.

Таблица 3. Показатели активности каталазы в проростках пшеницы «Московская 39» н а 7-е сутки

Варианты испытаний	Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода)	2,5
эпин	2,8
Экстракт ДГ,  10-4%	2,2
Экстракт ДГ, 10-6%	1,8
Экстракт ДГ, 10-8%	1,5

Активирование пероксидазы является характерной ответной биохимической реакцией растений, по которой можно судить об устойчивости растений. Уровень пероксидазы в 7-ми дневных проростках пшеницы увеличивался на в сравнении с контролем.

Наблюдалось снижение уровня каталазы в проростках пшеницы, обработанных раствором стевиози-да 10-8% на 40% в сравнении с контролем, в том числе наблюдали снижение уровня фермента относительно других ферментов антиоксидантной системы (табл.4).

Таблица 4 - Показат ели активности пероксидазы в проростках пшеницы «Московская 39» на 7-е сутки

Варианты испытаний	Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода)	60
эпин	68
Экстракт ДГ,  10-4%	72
Экстракт ДГ, 10-6%	74
Экстракт ДГ, 10-8%	70

Ферментом, определяющим ликвидацию активным форм кислорода, является аскорбатпероксидаза.

Результаты исследований уровня активности аскорбатпероксидазы представлены в таблице 5.

Таблица 5- Показатели активности аскорбатпероксидазы в проростках пшеницы «Московская 39»

на 7-е сутки

Варианты испытаний	Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода)	2,4
эпин	4,3
Экстракт ДГ,  10-4%	3,8
Экстракт ДГ, 10-6%	4
Экстракт ДГ, 10-8%	4,6

Из полученных результатов следует, что при выращивании растений, которые подвергали обработке экстрактами гликозидов в разных концентрациях наблюдали увеличение активности этого фермента по сравнению с контролем.

Поскольку одним из показателей повреждения клетки свободными радикалами является показатель уровня малонового диальдегида. Значение показателей уровня малонового диальдегида представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Показатели значений малонового диальдегида в проростках пшеницы «Московская 39»

на 7-е сутки

Варианты испытаний	Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода)	2,6
эпин	4,0
Экстракт ДГ,  10-4%	3,8
Экстракт ДГ, 10-6%	4
Экстракт ДГ, 10-8%	4,6

В наших экспериментах экстракт дитерпеноидов в концентрации 10-8% снижал образование диальдегида на 24%, что свидетельствует о его защитном влиянии на окислительный статус клетки.

Таким образом, дитерпеновые гликозиды вызывают в проростках пшеницы уменьшение содержания малонового диальдегида, увеличение активности антиоксидантных ферментов - пероксидазы и аскор- батпероксидазы, что свидетельствует о снижении окислительного стресса в растении. В результате проведенных исследований показано, что полученный экстракт дитерпеновых гликозидов из сухих листьев стевии можно использовать в качестве активного компонента перспективного регулятора роста растений.