Исследование влияния химиопрепаратов на уровень эндогенной интоксикации, интенсивность свободнорадикального окисления и мембранный аппарат клеток крови больных с рецидивами рака шейки матки в опытах in vitro

Рак шейки матки (РШМ) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у женщин [16]. Несмотря на относительно удовлетворительную (37,8– 58 %) 5-летнюю выживаемость больных РШМ, достаточно большое число пациенток этой категории погибают от прогрессирования заболевания, рецидивов и метастазов опухоли [17]. Лечение рецидивов РШМ является сложной клинической задачей, что обусловлено относительной резистентностью плоскоклеточного рака к большинству имеющихся цитостатиков, развитием массивных постлучевых изменений окружающих тканей, затрудняющих подвод адекватных доз препарата к опухолевому очагу, а также вследствие поражения мочевыводящих путей [8, 15].

В Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте для лечения данной категории больных применяется метод аутогемохимиотерапии (АГХТ), где в качестве среды для растворения химиопрепаратов используется аутокровь больного. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать влияние цитостатиков в опытах in vitro на показатели, отражающие степень эндогенной интоксикации, интенсивность свободнорадикального окисления и мембранный аппарат клеток крови у больных с рецидивами РШМ, что позволит расширить представление о механизмах действия АГХТ.

Материал и методы

В плазме крови 10 больных с рецидивами РШМ I–III стадий процесса были изучены интенсивность перекись-индуцированной лю-минолзависимой хемилюминесценции [18], активность церулоплазмина [7], содержание веществ средней молекулярной массы (МСМ254 и МСМ280) [2], уровень общей и эффективной концентрации альбумина (соответственно ОКА и ЭКА) [11], резервная связывающая способность альбумина (ССА=ЭКА/ОКА × 100 %) [10], коэффициент интоксикации (КИ), рассчитанный как (МСМ254/ЭКА) × 1000 [10], а также структурно-функциональные показатели мембран лимфоцитов и эритроцитов – текучесть в области белок-липидных контактов и липидного бислоя, полярность липидной фазы и погруженность белков в липидный матрикс мембран [1]. Исследования проводились до и после инкубации крови с химиопрепаратами – цисплатином и циклофосфаном, взятыми в количестве, соотносимом с терапевтической дозой. Время экспозиции составляло 40 мин, при температуре инкубации 37ºС. В качестве контроля использовали показатели 12–18 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту с обследованными больными.

Результаты и обсуждение

До инкубации с химиопрепаратами у больных с рецидивами РШМ большинство изученных показателей характеризовались значительными изменениями. Так, содержание МСМ280на 74,3 % превышало норму, эффективная концентрация альбумина была снижена на 31,5 %, а его связывающая способность, свидетельствующая о степени сорбции токсических лигандов, – на 31,1 % (табл. 1). Мы полагаем, что существенный вклад в выявленные нами метаболические нарушения вносит интенсификация свободнорадикальных процессов у больных с рецидивами РШМ, на что указывает увеличение уровня хемилюминесценции в 3,9 раза относительно донорских значений (табл. 1). По данным литературы, активация свободнорадикального окисления при неопластическом процессе приводит к накоплению в организме больных эндогенных липопероксидов, продуктов деградации белковых молекул, что вызывает блокирование или аллостерические изменения центров связывания на молекуле альбумина, снижение его комплексообразующей способности и транспортной функции [14]. Снижение ЭКА у обследуемой категории больных привело к почти двукратному увеличению коэффициента интоксикации (табл. 1), что свидетельствует о глубоком дисбалансе между накоплением и связыванием токсических лигандов.

Увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов у больных с рецидивами РШМ сопровождалось повышением содержания церулоплазмина – основного белкового антиоксиданта плазмы крови, в 2,1 раза по сравнению с нормой (табл. 1). Известно, что церулоплазмин оказывает мембраностабилизирующее действие на эритроциты, проявляющееся в повышении

Таблица 1

Показатели эндогенной интоксикации и свободнорадикального окисления в плазме крови больных с рецидивами рака шейки матки до и после инкубации с химиопрепаратами

Примечание: р – достоверность различий по сравнению с контрольной группой, р1 – достоверность различий по сравнению со значениями до инкубации.

Таблица 2

Показатели структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов у больных с рецидивами рака шейки матки до и после инкубации с химиопрепаратами

Примечание: р – достоверность различий по сравнению с контрольной группой, р1 – достоверность различий по сравнению со значениями до инкубации.

их перекисной резистентности [9]. Возможно, этим объясняется тот факт, что большинство структурных показателей мембран эритроцитов у больных с рецидивами РШМ не отличалось от нормы, лишь для погруженности белков в липидный матрикс эритроцитов отмечалась тенденция к ее увеличению на 25,1 % (табл. 2). В то же время другая картина наблюдалась в лимфоцитах: текучесть мембран в липидном бислое была снижена на 22,4 %, а текучесть в области белок-липидных контактов и погруженность белков в липидный матрикс были увеличены и достоверно превышали уровень доноров на 15,4 % и на 29 % соответственно (табл. 2). Тот факт, что негативному воздействию ПОЛ оказались подвержен в первую очередь мембраны лимфоцитов, может также объясняться повышенным содержанием свободных жирных кислот в лимфоцитарных мембранах по сравнению с эритроцитарными [6]. Известно, что окислительная модификация белковых компонентов мембраны вследствие интенсификации свободнорадикальных процессов сопровождается изменениями организации мембраны, в том числе и нарушением подвижности мембранных полипептидов, повышенной чувствительностью белков к протеолизу и конформационным изменениям [12]. Именно с этим мы связываем увеличение текучести мембран лимфоцитов в области белок-липидных контактов. Снижение текучести липидного бислоя мембран лимфоцитов, уменьшение подвижности белков в бислое ингибируют пролиферацию лимфоцитов и приводят к нарушениям в их мембранорецепторных комплексах, что влечет за собой угнетение функциональной активности этих иммунокомпетентных клеток [6, 13].

После инкубации крови с цитостатиками было обнаружено нарастание уровня МСМ254 на 35,1 % по сравнению с фоновыми значениями (табл. 1). Увеличение содержания веществ средней молекулярной массы мы связываем с фрагментацией белковых молекул под действием химиопрепаратов. Действительно, нами были выявлены достоверное снижение общей концентрации альбумина на 13,6 % и тенденция к снижению содержания церулоплазмина на 23,8 % (табл. 1). Также было обнаружено уменьшение эффективной концентрации альбумина и его связывающей способности на 43,8 % и 35,1 % соответственно (табл. 1), что свидетельствует о связывании химиопрепаратов молекулой альбумина. Подобные изменения привели к возрастанию коэффициента интоксикации в 2,1 раза по сравнению с фоновыми значениями.

Тот факт, что не все центры связывания молекулы альбумина оказались занятыми, указывает на преимущественное связывание циклофосфана и цисплатина с мембранами эритроцитов. По данным литературы, в присутствии белков определяющую роль в связывании лекарственных препаратов с эритроцитами играет величина свободной фракции препаратов в плазме [3]. После инкубации крови с химиопрепаратами большинство структурных характеристик мембран красных клеток крови, за исключением текучести в области липидного бислоя, остались в пределах нормы (табл. 2). Снижение текучести мембран эритроцитов в области липидного бислоя составляло 25,3 % относительно донорских величин и 28,9 % относительно фоновых значений. Мы полагаем, что выявленные нами структурные нарушения происходят за счет встраивания цитостатиков в липидный бислой мембраны эритроцитов, а не активации свободнорадикальных процессов, поскольку интенсивность хемилюминесценции осталась на прежнем уровне (табл. 1).

При исследовании структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов после инкубации крови с химиопрепаратами было выявлено, что полярность липидной фазы и погруженность белков в липидный матрикс лимфоцитарных мембран достоверно не изменялись по сравнению с фоновыми значениями, а их текучесть возросла как в области белок-липидных контактов, так и в липидном бислое на 47,1 % и 38,0 % соответственно (табл. 2). При этом текучесть в области белок-липидных контактов возросла на 69,7 % относительно значений у доноров, а в области липидного бислоя достигла нормальных величин. В связи с тем, что текучесть клеточных мембран во многом определяется содержанием в них сфингомиелина [4, 5], то выявленное нами увеличение текучести мембран лимфоцитов может быть вызвано расщеплением сфингомиелина под действием цитостатиков. Обнаруженное нами увеличение текучести лимфоцитарных мембран может свидетельствовать о стимуляции этих иммунокомпетентных клеток, поскольку известно, что активация лимфоцитов непосредственно связана с процессами, определяющими подвижность мембраны [6].

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что инкубация крови больных с рецидивами РШМ с циклофосфаном и цисплатином в используемой концентрации приводит к фрагментации белковых молекул с накоплением токсических продуктов их деградации, вследствие снижения связывающей способности альбумина, что обусловлено ассоциацией химиопрепаратов со связывающими центрами молекулы альбумина. Исходя из данных нашего исследования, преимущественное связывание химиопрепаратов происходит с мембранами эритроцитов, очевидно, путем встраивания в область липидного бислоя. Мы полагаем, что изначальная целостность мембран красных клеток крови у обследуемой категории больных и стимуляция лимфоцитов в результате действия химиопрепаратов имеют важное значение для реализации клинического эффекта аутогемохимиотерапии.