Исследование влияния липосомальной формы экстракта бадана толстолистного на формирование адаптационного потенциала организма

Известно, что адаптогены облегчают приспособление организма к разнообразным неблагоприятным условиям: физическим нагрузкам, жаре, холоду, жажде, стрессу и другим. Из-за неблагоприятной обстановки, сложившейся в настоящее время (повышенной радиации, массированного воздействия ксенобиотиков на организм), изучение закономерностей адаптационного процесса и поиск средств повышения функциональных резервов организма лежат в русле приоритетных задач современных медикобиологических наук. Следует отметить, что проблема парафармацевтической коррекции резистентности здорового человека к холодовому стрессу - одна из наименее изученных. В связи с этим создание новых корректоров адаптационного процесса на основе природных средств является особо актуальным на сегодняшний день [1].

Известно, что химический состав дикорастущих растений представлен широким набором различных химических соединений, многие из которых обладают высокой биологической активностью. Одним из широко распространенных на территории Бурятии лекарственных растений является бадан толстолистный [2].

Целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение влияния экстракта черных листьев бадана толстолистного, включенного в липосомальные структуры, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты, на формирование адаптационного потенциала организма в условиях холодового воздействия .

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили липосомы на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира нерпы [3], нагруженные водным раствором экстракта сухого из черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ). ЭБТ получали по методу, разработанному в лаборатории химико-фармацевтических исследований Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН [4].

Исследования проводились на белых лабораторных крысах с массой тела 200-250 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария на полноценном водном и пищевом рационе. Для моделирования холодового стресса животных ежедневно в утренние часы на 3 часа помещали в климатокамеру при температуре минус 15±2°С в течение 21 дня.

Одновременно исследовали 5 групп животных (n=10): 1 – интактная - находилась в стандартных условиях вивария; остальных животных подвергали охлаждению по приведённой выше схеме и делили на следующие группы: 2 – контрольная; 3 – подопытная – ежедневно перед помещением в климатока- меру крысам вводили внутрижелудочно водный раствор экстракта черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ) в дозе 100 мг/кг массы тела; 4 - подопытная - вводили внутрижелудочно липосомы (ЛС) в дозе 20 мг/кг; 5 - подопытная - вводили внутрижелудочно липосомальную форму экстракта черных листьев бадана толстолистного (ЛС+ЭБТ) в аналогичных объемах.

Об адаптогенных свойствах липосомальной формы ЭБТ судили по времени выносливости в стандартном тесте плавания до полного утомления (плавание «до отказа») при температуре воды +30 ° С. Критерием наступления полного утомления в тесте плавания служило полное погружение головы животного под воду в течение 5 секунд.

Ориентировочно-исследовательское поведение и суммарную двигательную активность определяли в тесте «открытое поле» в течение 5 минут. Также оценивали эмоциональность животных по тесту дефекации и груминга.

Показатели иммунного статуса экспериментальных животных на фоне введения испытуемых средств оценивали по количеству лейкоцитов и субпопуляций лимфоцитов в крови при постановке непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции [5].

С целью оценки состояния антиоксидантной системы у животных определяли активность каталазы [6], супероксиддисмутазы (СОД) [7] и восстановленного глутатиона в крови общепринятыми методами [8].

Для оценки влияния средств на состояние гематологических показателей у животных определяли концентрацию гемоглобина гемоглобинцианидным методом и вычисляли лейкоцитарную формулу крови общепринятым методом.

Результаты исследований

|60,00

S 50,00 540,00

§30,00

g 20,00 | 10,00

§0,00

бЗЖ

17 день

О 14 день

О 21 день

интактная контроль ЛС ЭБТ ЛС+ЭБТ

Рис. 1. Продолжительность плавания крыс при длительном холодовом стрессе на фоне введения исследуемых средств

Методика плавания является наиболее удобной для интегральной характеристики состояния организма и его физической выносливости и только в условиях, угрожающих жизни, можно заставить животное «работать до полного измождения».

Измерения длительности плавания крыс проводили на 7-е, 14-е и 21-е сутки эксперимента (рис. 1). По данным исследований установлено, что холодовое воздействие достоверно снижало устойчивость к плаванию крыс во все сроки эксперимента. Так, на 7-й день эксперимента продолжительность плавания интактных крыс составила 44,70±5,89 мин, тогда как у крыс, подвергнутых холодовому воздействию, -37,81±2,95 мин. Аналогичные данные наблюдались на 14-е и 21-е сутки.

Увеличение работоспособности животных, адаптирующихся к холоду, при введении им липосом, было отмечено начиная с 14-х суток эксперимента, а при введении ЭБТ - только на 21-е сутки (продолжительность плавания составляла 46,03±5,05 и 47,62±6,80 мин соответственно). При введении же липосомальной формы ЭБТ исследуемый показатель достоверно увеличился уже на 7-е сутки опыта и составил 49,88±6,4 мин. Известно, что функциональное состояние центральной нервной системы зависит от адаптационных возможностей организма. Помещение животного в новое окружение способствует возникновению исследовательского поведения, которому в то же время препятствуют условия, вызывающие страх. Так, в тесте «открытое поле» установлено, что животные интактной группы характеризовались высоким уровнем исследовательского поведения (95,20±0,8 у.е.) и высокой суммарной двигательной активностью, при этом 16% от показателя двигательной активности приходилось на посещение внутренней части поля (табл.1).

Таблица 1

Влияние липосомальной формы экстракта бадана толстолистного на нейротропную активность животных

Группы животных	Посещение периферической части поля (у.е.)	Посещение центральной части поля (у.е.)	Груминг (у.е.)	Эмоции (у.е.)
Интактная	95,20±0,8	3,56±0,2	27,49±0,3	1,96±0,2
Контроль	85,70±3,1 *	2,34±0,2 *	24,45±0,1 *	1,85±0,2
ЛС	86,45±8,7	2,96±0,3’"	24,78±0,2 *	2,00±0,1
ЭБТ	87,34±3,4 *	2,98±0,5	25,00±0,1 *	1,90±0,2
ЛС + ЭБТ	89,73±4,2	3,00±0,1 *,**	25,24±0,7 *	2,12±0,4

Примечание (к табл. 1-3): * - достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по отношению к интактным животным; (p<0,05);

** - достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по отношению к контрольной группе животных; (p<0,05).

Животные контрольной группы были эмоциональны - число дефекаций за 5 минут составило 1,96±0,3. Акты груминга наблюдались у 60% животных. Животные данной группы проявляли меньший уровень исследовательского поведения и характеризовались менее высокой поведенческой активностью. Для животных этой группы были характерны повышенная возбудимость, суетливость и на 5-й минуте эксперимента движения становились вялыми, наступала быстрая утомляемость.

Как показали результаты, под влиянием исследуемых средств показатели реакции нервной системы подопытных крыс приближались к уровню интактной группы, животные становились более спокойными и уравновешенными, улучшались мотивационные характеристики поведения, повышался уровень ориентировочно-исследовательского поведения, снижался уровень тревоги, страха, неуверенности. Исследуемые показатели в группе животных, получавших ЭБТ в составе липосом, были более высокими, чем в двух других подопытных группах.

По-видимому, усиление нейроадаптогенных характеристик растительного средства при включении его в липосомальные структуры связано с синергическим взаимодействием биологически активных веществ, содержащихся в черных листьях бадана, и ПНЖК жира байкальской нерпы.

Известно, что изменение физиологического иммунного ответа способствует развитию аллергических и аутоиммунных состояний, приводящих к снижению адаптационного потенциала организма. Иммунные реакции направлены на поддержание постоянства внутренней среды организма, нарушаемого поступлением в него микробов, вирусов, а также других чужеродных веществ растительного и животного происхождения. Иммунная система осуществляет важную функцию своеобразного надзора за индивидуальностью организма, обеспечивая распознавание и удаление из него чужеродных белков и клеток. В связи с этим обстоятельством изучение состояния иммунной системы и изменение её характеристик под влиянием различных воздействий является обязательным для оценки иммунотропного эффекта исследуемых средств. При исследовании иммунного статуса экспериментальных животных следует отметить, что во всех группах выражена лейкопения - снижение содержания лейкоцитов составило 21,134,4% по сравнению с интактной группой (табл. 2).

Абсолютное значение количества лимфоцитов (количество клеток в единице объема) в группе крыс, получавших липосомальную форму фитоэкстракта, было достоверно выше по сравнению с интактной. У остальных групп этот показатель был ниже, чем в интактной группе. В опытных группах, получавших ЛС+ЭБТ и ЛС, наблюдалось достоверное повышение относительного количества лимфоцитов (% от общего числа лимфоцитов) по сравнению с интактной на 10,9 и 8,9% соответственно. В группе животных, получавших ЭБТ, наблюдалось снижение показателя на 10,7% по сравнению с интактной.

Абсолютное значение CD3-клеток (суммарная Т-популяция лимфоцитов) во всех группах было достоверно ниже по сравнению с интактной (разница составляла от 33% в группе ЛС до 52% в контрольной группе). При этом показатель относительного количества Т-лимфоцитов также был достовер -но ниже как в контрольной, так и в опытных группах животных по сравнению с интактной.

Таблица 2

Показатели иммунного статуса животных при введении липосомальной формы экстракта бадана толстолистного на фоне холодового стресса

	Группы животных
Показатели	Интактная	Контрольная	ЛС	ЭБТ	ЛС+ЭБТ
Лейкоциты, абс.ч.	9,76±0,5	7,7±1,2 *	7,53±1,1 *	6,4±2,3 *	6,6±2,1 *
Лимфоциты, %	48,67±8,7	50,76±5,6	53±3,45 *	43,5±5,6 **	54±4,7 *
Лимфоциты, абс.ч.	4,56±0,6	3,74±0,2 *	4,09±0,3 **	2,84±1,2 *	4,64±0,4 **
CD3, %	54±4,3	31,76±1,2 *	37,67±1,2 */**	40±2,3 */**	25±1,6 '/"
CD3, абс.ч.	2,41±0,2	1,16±0,3 *	1,61±0,4 */**	1,18±0,3 *	1,18±0,2 *
CD4, %	30±2,6	33,33±4,2	32±3,7	41,5±2,9 */**	26,6±1,9 */**
CD4, абс.ч.	1,36±0,2	1,23±0,3	1,29±0,4	1,12±0,3	1,23±0,4
CD8, %	31,67±2,5	19±2,2 *	19,67±1,8 *	28±2,1 */**	23±2,4 */**
CD8, абс.ч.	1,39±0,1	0,7±0,5 *	0,74±0,3 *	0,86±0,02 *	1,05±0,2 *
CD16, %	15±1,2	26,33±2,3 *	22,33±2,9 */**	19±1,6 */**	18±1,9 '/"
CD16, абс.ч.	0,68±0,3	0,99±0,03 *	0,93±0,06	0,63±0,01 **	0,84±0,04 **
HPH(CD4:CD8)	0,98±0,03	2,03±0,2 *	1,82±0,4 *	2,18±0,6 *	1,18±0,4 **

Данные иммунограммы показали, что во всех экспериментальных группах отмечалось снижение абсолютного количества Т-хелперной популяции лимфоцитов (CD4) до 18% по сравнению с интактной. При этом относительное количество Т-хелперов в группе ЛС+ЭБТ достоверно уменьшалось по сравне-нию с интактными животными на 11,4%. Также в ходе эксперимента выявлено, что в крови экспериментальных животных снижалась Т-супрессорная активность по сравнению с интактными, что выражалось в снижении значений абсолютного количества CD8-клеток на 24,5-50%. Аналогичная закономерность наблюдалась в изменении относительного количества Т-супрессоров: у всех экспериментальных животных числовые значения были достоверно ниже по сравнению с группой интактных животных. Таким образом, иммунорегуляторный коэффициент CD4/CD8 (соотношение основных субпопуляций Т-лимфоцитов) достоверно увеличивался во всех группах животных до 2,2 раза по сравнению с интактной группой.

Установлено, что у животных на фоне холодового стресса повышалось содержание клеток, несущих маркер естественных киллеров (CD 16), как в абсолютных значениях, так и в относительных по сравнению с уровнем у интактных животных.

По-видимому, изменения в клеточном звене иммунитета происходят за счет перестройки плазматических мембран и активации рецепторного аппарата иммунных клеток эссенциальными фосфолипидами и высокоактивными жирными кислотами, входящими в состав жира нерпы.

Особая роль в реализации адаптационного потенциала организма отводится полифункциональной системе антиоксидантной защиты, которая способна реагировать на широкий спектр факторов (холод, жара и т.д.), приводящих к нарушению гомеостаза в обмене веществ у организма.

Холодовый стресс вызывал у крыс значительное снижение активности ферментов антиоксидантной защиты, что выражалось в уменьшении уровня каталазы на 24%, супероксиддисмутазы - на 72% и восстановленного глутатиона - на 47% в контрольной группе животных по сравнению с аналогичными данными интактных животных.

Как известно, важная роль в системе антиоксидантной защиты принадлежит каталазе. Повышение уровня этого фермента оказывает стимулирующее влияние на результативность ферментативного звена антиокислительной системы организма. В ходе эксперимента выявлено, что в группах животных, получавших растительный экстракт и липосомы, было отмечено незначительное повышение каталазы на 6% (ЭБТ) и 13% (ЛС) по сравнению с показателем в контрольной группе. Тогда как активность каталазы у крыс, которым вводили липосомальную форму фитоэкстракта, достоверно повышалась на 18% по сравнению с контролем.

Известно, что повышение уровня супероксиддисмутазы происходит в результате усиления цитотоксического действия перекиси водорода, образующейся в результате дисмутации супероксида. В начальный период этих процессов наблюдается повышение активности СОД, которое носит компенсаторный характер. В стадии декомпенсации антиоксидантных процессов активность СОД снижается [7]. Результаты эксперимента показали достоверное повышение активности этого фермента у животных всех опытных групп более чем в 1,5 раза (ЭБТ - на 90%, ЛС - на 98%, ЛС+ЭБТ - на 72%) по сравнению с контрольной. При этом уровень СОД в опытных группах не достигал значения интактной.

В защите клеток от оксидантного стресса ключевая роль отводится системе глутатиона. Глутатион участвует практически во всех стадиях ферментативной защиты клетки от активных форм кислородных соединений. Как показали исследования, содержание восстановленного глутатиона достоверно повышалось у всех подопытных животных на 51,2, 48,5 и 49,7% соответственно в группах ЭБТ, ЛС и ЛС+ЭБТ по сравнению с контролем. Как и в случае с СОД, уровень этого фермента не достигал соответствующего значения в интактной группе.

Полученные данные свидетельствуют о выраженном антиоксидантном действии испытуемых средств на фоне холодового стресса. По-видимому, такое действие объясняется непосредственным взаимодействием биоактивных соединений фитоэкстракта и полиненасыщенных жирных кислот жира нерпы с продуктами свободнорадикального окисления, сопровождающимися повышением активности эндогенных систем защиты. Так, исследуемый экстракт черных листьев бадана толстолистного содержит в своем составе комплекс фенольных соединений (дубильных веществ, флавоноидов, фенолокис-лот, галлотаннинов и др.), обладающих, как известно, выраженной антиокислительной и мембраностабилизирующей активностью.

Установлено, что синергизм действия биологически активных веществ черных листьев бадана толстолистного и жира нерпы был наиболее ярко выражен при оценке активности каталазы, что выражалось в увеличении исследуемого показателя у животных, получавших включенный в липосомальные структуры фитоэкстракт, по сравнению с применением только растительного средства и только липосом. Хотя действие биологически активных веществ черных листьев бадана толстолистного и жира нерпы на комплекс антиокислительных ферментов не дало столь высокого эффекта, все же фармакологическая активность комбинированного средства при этом не снижалась. Это подтверждает тот факт, что совместное действие двух и более биологически активных веществ не всегда является суммой их фар -макологических эффектов, а проявляется в новом качестве, что свидетельствует о необходимости проведения дополнительных исследований антиоксидантной активности комплексного средства.

Гематологические лабораторные показатели служат неотъемлемой частью оценки состояния орга-низма, в том числе и его адаптационных возможностей. Изучение лейкоцитарной формулы и уровня гемоглобина крови имеет большое значение в диагностике гематологических, инфекционных, воспалительных заболеваний, а также оценке тяжести состояния организма и эффективности проводимой терапии.

Исследования лейкоцитарной формулы не показали особенных изменений у подопытных животных по сравнению с интактной группой (табл. 3), что, по всей видимости, свидетельствует об отсутствии развития каких-либо воспалительных, гематологических или инфекционных заболеваний у животных в течение эксперимента.

Таблица3

Лейкоцитарная формула крови лабораторных животных при введении экстракта бадана толстолистного, включенного в липосомальные структуры, % (n=10)

Группы животных	Нейтрофилы		Эозино-филы	Базофилы	Моноциты	Лимфоциты
	палочкоядерные	сегменто-ядерные
Интактная	2,3±0,76	20,4±2,3	1,68±0,23	0,68±0,04	2,6±0,55	68,44±2,04
Контроль-ная	2,6±0,3	20,14±1,61	1,82±0,36	0,55±0,29	2,43±0,39	63,08±3,47 *
ЛС	2,4±0,48	21,6±2,46	1,63±0,3	0,61±0,22	2,3±0,49	66,2±3,03
ЭБТ	2,1±0,25	20,6±2,07	1,71±0,41	0,58±0,38	1,9±0,4 ''"	66,4±3,21
ЛС+ЭБТ	1,8±0,3"	22,9±1,43	1,2±0,84	0,89±0,28	2,7±0,74	65,3±2,6 *

Исследования уровня гемоглобина в крови крыс показали незначительное его увеличение в контрольной группе животных по сравнению с интактной. Вероятно, это связано с адаптацией организма животных к холодовому воздействию, что проявилось в увеличении концентрации гемоглобина.

Таким образом, в результате экспериментов было установлено, что липосомальная форма экстракта из черных листьев бадана толстолистного оказывала иммуномодулирующее, антиоксидантное действие в условиях холодового стресса. При этом прослеживался синергизм действия биологически активных веществ черных листьев бадана и жира нерпы, который выразился в увеличении фармакологической активности фитоэкстракта при включении его в липосомальные структуры. Липосомальная форма экстракта черных листьев бадана толстолистного может быть рекомендована в качестве профилактического средства, снижающего выраженность стресс-синдрома, для повышения устойчивости организма к воздействию экстремальных факторов, и, в частности, холода.