Исследование влияния свободных и инкапсулированных клеток пробиотического штамма Weizmannia coagulans на свойства пробиотического кисломолочного продукта и оценка их выживаемости в имитированных условиях ЖКТ

В связи с повсеместным распространением культуры здорового образа жизни, а также повышением потребительской грамотности в вопросах нутрициологии, наблюдается повышенный интерес к функциональным пищевым продуктам, обладающим доказанным положительным воздействием на здоровье человека. Особое место в этой категории занимают пробиотические кисломолочные продукты, содержащие живые культуры пробиотических микроорганизмов. Пробиотики способны корректировать нарушения кишечного микробиома, возникшие из-за приема антибиотиков, стресса или неправильного питания, могут снижать уровень холестерина, поддерживать иммунитет организма и улучшать усвоение минералов [1]. Для эффективной работы пробиотиков, их жизнеспособность в потребляемом продукте должна быть не ниже 107 КОЕ на миллилитр или грамм потребляемого продукта [2]. Сохранность пробиотических культур в кисломолочных продуктах зависит от множества факторов: условий производства продукта, обработки и хранения [3]. При этом жизнеспособность пробиотических штаммов при прохождении через агрессивную среду желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеет принципиальное значение, поскольку именно этот фактор определяет их оздоровительный эффект [4].

Биоматериал, используемый в качестве матрицы-носителя, должен обладать способностью к гелеобразованию, быть нетоксичным, экономичным и доступным. Данными свойствами обладают следующие биоматериалы: альгинат натрия, пектин и κ-каррагинан [9–12]. Многочисленными научными исследованиями доказана высокая эффективность инкапсуляции и хорошая выживаемость пробиотических бактерий при использовании данных биоматериалов [13]. Наличие второго слоя биоматериала при изготовлении капсул влияет на эффективность доставки капсул до нужного отдела кишечника, где должно происходить высвобождение клеток пробиотиков. В качестве второго слоя часто используется хитозан [14]. Молекулы хитозана имеют положительный заряд, тогда как полисахариды первого слоя капсул обладают отрицательным зарядом, что повышает прочность капсул [15].

При выборе пробиотической культуры для технологии инкапсуляции ключевыми факторами являются выживаемость в процессе капсулирования и доказанная эффективность штамма. В предыдущем исследовании нашей научной группой были подробно изучены пробиотические свойства штамма W. coagulans , относящегося к семейству Bacillaceae [16].

Пробиотические кисломолочные продукты обладают целым комплексом полезных свойств для здоровья человека и представляют собой ценный функциональный продукт питания [17]. Данный продукт популярен и может содержать в своем составе большое количество полезных микроорганизмов. Дополнительное обогащение кисломолочного продукта пробиотиками может оказывать влияние на его сенсорные и физико-химические показатели [18]. В процессе хранения и ферментации рН кисломолочного продукта может снижаться, что может негативно влиять на бактерии-пробиотики, находящиеся в виде свободных клеток. Свободные клетки также не могут противостоять жестким условиям ЖКТ и погибают [19]. В связи с чем, актуальной задачей является создание кисломолочных продуктов с дополнительным обогащением инкапсулированными клетками пробиотических микроорганизмов, которые благодаря защитному биополимеру, будут эффективно доставляться в толстый кишечник человека. Основные задачи данного исследования включают изготовление капсул с двойным слоем с использованием различных доступных полисахаридов, обогащение ими кисломолочного продукта и оценку их выживаемости в условиях хранения готового продукта и в имитированных условиях ЖКТ, оценку некоторых физикохимических, сенсорных и реологических показателей обогащенного кисломолочного продукта.

Материалы и методы

В работе использовали пробиотическую культуру Weizmannia coagulans и обычную культуру, традиционно применяемую в заквасках для кисломолочных продуктов, Streptococcus thermophiluS. Обе культуры выделены коллективом авторов из природных источников и депонированы в научном музее кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВО ВГУИТ.

Для изготовления капсул использовали альгинат натрия (Qingdao Nanshan Seaweed, Китай), низкоэтерифицированный амидированный пектин (НЭА), κ-каррагинан (ООО Вектор, Россия), хитозан (Sigma-Aldrich, США), хлорид кальция (CDH, Индия), Твин 80 (Ленреактив, Россия), подсолнечное масло. Для производства кисломолочного продукта использовали восстановленное обезжиренное стерилизованное молоко. Для культивирования микроорганизмов использовали MRS агар и агар Streptococcus Thermophilus Isolation (Himedia, Индия).

Культивирование пробиотической культуры W. coagulans проводили в течение 24 ч при 37⁰ С в предварительно отстерилизован-ном 10% восстановленном молоке. Начальную концентрацию клеток W. coagulans до инкапсуляции устанавливали путем глубинного посева на агаризованную среду MRS.

Изготовление капсул с пробиотической культурой W. coagulans проводили по ранее описанной методике методом эмульсии, использовали различные сочетания полисахаридов: альгината натрия, пектина и κ-каррагинана, дополнительно покрывали вторым слоем хитозана [20]. Капсулы были лиофилизированы и использованы для приготовления пробиотического кисломолочного продукта (Таблица 1).

Таблица 1.

Состав капсул с культурой W. coagulans

Table 1.

Composition of the obtained capsules

Капсулы Capsules	Состав капсул/capsule composition
	1 слой капсул | 1 layer of capsules			2 слой капсул | 2 layer of capsules
	Компонент 1	Компонент 2	Компонент 3	Компонент
А-П	2% альгинат натрия	3% пектин	-	1% хитозан
А-П-К	2% альгинат натрия	3% пектин	2% к-каррагинан	1% хитозан

Кисломолочный продукт производили согласно способу, описанному Головач [21]. Обезжиренное восстановленное молоко стерилизовали при температуре 121 °C в течение 11 минут, охлаждали до 45 °C. Каждый образец инокулировали культурой S. thermophilus (1% по объёму). Пробиотический кисломолочный продукт производили путем добавления свободных клеток или инкапсулированных культуры W. coagulanS. Было приготовлено четыре различных образца:

• 1.    Контроль. Кисломолочный продукт, содержащий 1% по объему инокулята S. thermophiluS. (свS контроль)

• 2.    Кисломолочный продукт, содержащий 1% по объему инокулята S. thermophilus , и 0,5% по объему свободных клеток W. coagulanS. (свS+свW)

• 3.    Кисломолочный продукт, содержащий 1% по объему инокулята S. thermophilus ,

• 4.    Кисломолочный продукт, содержащий 1% по объему инокулята S. thermophilus , 0,5% по объему клеток W. coagulans инкапсулированных в А-П-К. (свS+кW+А-П-К)свS, свW – свободные клетки культур S. thermophilus, W. Coagulans кW – капсулированные клетки культуры W. coagulans

0,5% по объему клеток W. coagulans инкапсулированных в А-П. (свS+кW+А-П)

Все партии разливали в колбы и инкубировали при температуре 42–45 °C на протяжении 6 ч до образования сгустков. Затем часть колб анализировали, остальные хранили в течение 21 дня при 4 °C ± 1.

Сенсорный анализ пробиотических кисломолочных продуктов проводили по ГОСТ 31981–2013 «Йогурты. Общие технические условия» [22].

Количественный учет пробиотических микроорганизмов в кисломолочном продукте при хранении проводили по методике, описанной Frakolaki et al. [18]. Образцы отбирали и анализировали из каждой партии через несколько промежутков времени после производства: 0, 7, 14, 21 день. Образцы кисломолочного продукта разбавляли до 100 мл физиологическим раствором, смешивали в гомогенизаторе и глубинно высевали на MRS агар, инкубировали при 37 °C (45 °C для учета S. thermophilus ) в течение 48 часов. После инкубации проводили подсчет жизнеспособных пробиотических клеток, с последующим пересчетом на логарифмическое значение колониеобразующих единиц на 1 мл продукта (Log 10 КОЕ/мл).

Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 31976–2012 [23].

Синерезис определяли методом центрифугирования, описанным Головач [24]. Степень синерезиса рассчитывали по формуле (1):

V

СС =   ^с- Х 100 ,            (1)

V пр где СС – степень синерезиса, %; V с – объем, выделившейся при центрифугировании сыворотки, мл; V пр – объем пробы в центрифужной пробирке, мл.

Все эксперименты были выполнены в трёх повторностях (n = 3). Полученные результаты были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Дисперсионный анализ (ANOVA) был выполнен с пост-тестом Тьюки, различия считались статистически значимыми при р<0,05, и с использованием программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).

Результаты и обсуждение

• 1 . Оценка жизнеспособности инкапсулированных и свободных клеток в имитированных условиях ЖКТ

Incubation duration, h

Рисунок 1. Жизнеспособность инкапсулированных и свободных клеток W. coagulans в разных образцах пробиотических кисломолочных продуктов после двух часов воздействия условий, имитирующих желудок. * – статистически значимые результаты по отношению к образцу кисломолочного продукта свS+свW (p<0,05)

Figure 1. Viability of encapsulated and free W. coagulans cells in different probiotic fermented milk product samples after two hours of exposure to artificial conditions simulating the stomach. * – statistically significant results in relation to the fermented milk product sample freeS+freeW (p<0.05)

• 2    Сенсорный анализ образцов пробиотического кисломолочного продукта.

Сенсорный анализ образцов кисломолочного продукта, содержащих свободные и инкапсулированные клетки W. coagulans проводился сразу после приготовления образцов и спустя 21 сутки хранения при 4 °C. Результаты представлены в таблице 2. Все образцы полученных кисломолочных продуктов сразу после приготовления были молочно-белого цвета, и обладали приятным кисломолочным вкусом и запахом. По истечении 21 дня хранения в образце свS+кW+А-П, содержащем капсулы из смеси альгината и пектина, вкус приобрел сладковатый оттенок. Вкус образца свS+кW+А-П-К с капсулами из альгината пектина и каррагинана стал кисловатым. Изменений остальных показателей отмечено не было. Схожие результаты получили и другие исследователи Kailasapathy и Pour [27, 28].

имели достаточно однородную консистенцию

Таблица 2.

Органолептическая характеристика кисломолочных продуктов

Table 2.

Organoleptic characteristics of fermented milk product

Показатель Indicator	Образец | Sample
	готовый				21 день
	ьД Ч О .я О) 8	м + О) 8	с + О) 8	с + О) 8	Ч 8	м + О) 8	с + О) 8	с + О) 8
Внешний вид и консистенция Appearance and consistency	Однородная, с ненарушенным сгустком, с незначительным отделением сыворотки Homogeneous, with an intact clot, with slight separation of serum				Однородная, с ненарушенным сгустком, с незначительным отделением сыворотки Homogeneous, with an intact clot, with slight separation of serum
Вкус и запах Taste and smell	Чистый, приятный, кисломолочный	Чистый, кисломолочный	Чистый, приятный, кисломолочный		Запах приятный вкус кисломолочный	Запах и вкус кисломолочный	Запах кисломолочный, вкус кисломолочный и немного сладковатый	Запах приятный кисломолочный, вкус кисловатый
Цвет Color	Однородный, молочно-белый Homogeneous, milky white				Однородный, молочно-белый Homogeneous, milky white

• 3    Оценка числа жизнеспособных клеток в кисломолочном продукте при хранении

  На протяжении всего процесса хранения происходит изменение ряда физико-химических показателей кисломолочного продукта. Заквасочная культура для кисломолочного продукта S. thermophilus даже при охлаждении может продуцировать молочную кислоту вследствие ферментации лактозы, что приводит к снижению рН или к увеличению титруемой кислотности [29]. Как видно из рисунка 2, титруемая кислотность всех образцов кисломолочного продукта возрастает в течение 21 дня хранения и находится в пределах 92–110 °Т и отвечает нормам ГОСТ 31981–2013. Повышение кислотности кисломолочного продукта оказывает влияет на жизнеспособность клеток пробиотиков, это видно на рисунке 3.

0             7             14            21

Продолжительность хранения, сутки Storage intervals, days

—•—свS+свW

—■—свS+кW+А-П

—•—свS+кW+А-П-К

Рисунок 2. Динамика титруемой кислотности образцов кисломолочного продукта в течение 21 дня хранения при 4 °С

• Figure 2.    Titratable acidity of fermented milk product samples during 21 days of storage at 4 °С

Свободные клетки W. coagulans показали более быстрое снижение жизнеспособности до значения 6,10 Log 10 КОЕ/мл. Напротив, кисломолочные продукты с капсулированными клетками показали лучшее сохранение числа жизнеспособных клеток, которое к 21 дню хранения составило 9,74 (свS+кW+А-П) и 9,15 (свS+кW+А-П-К) Log 10 КОЕ/мл. Повышенная сохранность инкапсулированных культур объясняется тем, что матрица-носитель эффективно защищает клетки от вредного действия кислотности кисломолочного продукта и окислительных процессов [30]. Данные о жизнеспособности свободных и капсулированных клеток культуры W. coagulans в других литературных источниках на сегодняшний день отсутствуют.

Продолжительность хранения, сутки storage intervals, days свS+свW ■ свS+кW+А-П s свS+кW+А-П-К

Рисунок 3. Жизнеспособность свободных и инкапсулированных клеток W. coagulans в кисломолочном продукте в течение периода хранения (0, 7, 14, 21 день). * – статистически значимый результат по отношению к свободным неинкапсу-лированным клеткам (p<0,05)

• Figure 3.    Viability of free and encapsulated W. coagulans cells in fermented milk product during storage intervals (0, 7, 14, 21 days). * – statistically significant result in relation to free non-encapsulated cells (p<0.05)

4 Влияние добавления свободных и капсулированных клеток W. coagulans на реологические характеристики кисломолочного продукта.

К реологическим характеристикам кисломолочного продукта относят вязкость и синерезис, именно эти показатели определяют консистенцию готового продукта [31]. Вязкость влияет на стабильность и вкус кисломолочного продукта [32]. Во всех образцах приготовленного кисломолочного продукта наблюдалось снижение вязкости. Наиболее высокая вязкость наблюдалась в контрольном образце, содержащем только свободные клетки S. thermophilus, предположительно это связано с выработкой экзополисахаридов (ЭПС), хотя данный показатель не измерялся в данном исследовании. В образце с добавлением свободных клеток W. coagulans наблюдалось наименьшее значение вязкости кисломолочного продукта за счет образования кислот, влияющих на структуру образца (рисунок 4).

0            7            14           21

Продолжительность хранения, сутки Storage intervals, days

—о—свS

^3  свS+свW

—■— свS+кW+А-П    △ свS+кW+А-П-К

Рисунок 4. Вязкость образцов пробиотического кисломолочного продукта в течение периода хранения (0, 7, 14, 21 день)

• Figure 4.    Viscosity of probiotic yogurt samples during storage intervals (0, 7, 14, 21 days)

Было установлено, что во всех образцах кисломолочного продукта отмечалось увеличение синерезиса к концу срока хранения (рисунок 5). Высокие показатели синерезиса, вероятно, обусловлены ростом кислотности в результате метаболической активности культуры S. thermophilus во время хранения. Наибольшие значения синерезиса наблюдались в образце (свS+свW), это может быть связано с преобразованием твердых веществ кисломолочного продукта в различные метаболиты обоими видами бактерий. Pour с соавторами также сообщали о более высоких значениях синерезиса в образцах, содержащих свободные клетки в сравнении с капсулированными [28].

Продолжительность хранения, сутки storage intervals, days

Рисунок 5. Степень синерезиса образцов пробиотического кисломолочного продукта в течение периода хранения (0, 7, 14, 21 день). * – статистически значимый результат по отношению к образцам свS, свS+кW+А-П, свS+кW+А-П-К (p<0,05)

Figure 5. Syneresis of probiotic yogurt samples during storage intervals (0, 7, 14, 21 days). * – statistically significant result in relation to samples svS, svS+kW+A-P, svS+kW+A-P-K (p<0.05)

post@vestnik-vsuet.ru Заключение

В ходе исследования было установлено, что капсулированные клетки пробиотической культуры W. coagulans , содержащиеся в кисломолочном продукте, показали высокую выживаемость в имитированных условиях ЖКТ в сравнении со свободными клетками. Жизнеспособность пробиотических капсулированных клеток образцов свS+кW+А-П и свS+кW+А-П-К в ходе хранения на протяжении 21 дня снижалась незначительно в сравнении с образцом, содержащим свободные клетки пробиотика, которые оказались более восприимчивы к снижению кислотности кисломолочного продукта. Добавление как капсулированных, так и свободных клеток пробиотика значительно не повлияло на сенсорные показатели готового продукта как сразу после приготовления, так и на конец срока хранения. Добавление капсулированных клеток в сравнении со свободными оказывало значительное влияние на реологические свойства и текстурные характеристики готового кисломолочного продукта. Настоящее исследование может быть полезным для молочной промышленности и поможет сохранить выживаемость пробиотиков на высоком уровне как в готовом продукте, так и после попадания в ЖКТ.

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект FZGW-2024–0003)