Исследование влияния ультразвуковой обработки в жидких средах различного состава на поверхностную микрофлору мясных полуфабрикатов

Обеспечение микробиологической стабильности мяса и мясопродуктов на всех стадиях технологического процесса производства и реализации является важной задачей для производителей. Решение этой задачи связано с подавлением развития устойчивой к физическим и химическим факторам посторонней микрофлоры [1, 2].

Для предотвращения микробиологической порчи мясо и мясные продукты подвергают различным видам обработки, основным из которых является действие температур – низких (охлаждение, замораживание) или высоких (пастеризация, стерилизация). Однако, эти методы обеспечивают либо замедление микробиологических процессов, но не стерилизацию продукта, либо снижают его пищевую и биологическую ценность [1-3].

В этой связи особую актуальность приобретает изучение инновационных методов, гарантирующих потребителю безопасные и минимально обработанные продукты. Большим потенциалом в этом отношении обладает применение молочнокислых бактерий (МКБ) и обработка ультразвуком (УЗ) [3-13].

Антагонистическая активность МКБ против многих патогенных, условно-патогенных бактерий и микроорганизмов порчи пищевых продуктов обусловлена, в первую очередь, продуцированием молочной кислоты, снижающей рН среды до значений, неблагоприятных для многих групп микроорганизмов. Особый интерес представляет продуцирование некоторыми штаммами Lactobacillus acidophilus ( L. acidophilus )специфических полипептидов – бактериоцинов – различающихся по силе и спектру антибиотического действия, также рядом других свойств, что делает их перспективными для использования в пищевой промышленности. Результат антагонистического воздействия может проявляться в виде замедления или остановки роста тест-микроба, гибели и даже лизисе его клеток [4, 6-9, 14].

Широкое же применение УЗ в пищевых технологиях как нетеплового метода стерилизации и инактивации микроорганизмов связано, в первую очередь, с явлением кавитации, сопряженным с бактерицидным эффектом при достижении определенной пороговой интенсивности. Однако, ниже пороговой интенсивности не только не наступает разрушение жизнеспособных микроорганизмов, а наблюдается стимуляция роста их числа. [3, 5, 10-12].

Облучение УЗ приводит к нарушению механической целостности (разрыв клеточных стенок, мембран и других цитоплазматических структур) и внутренних процессов жизнедеятельности (изменение равновесной концентрации веществ вне и внутри клетки, инактивация ферментов и коагуляция белков) клеток микроорганизмов, что ведет к их гибели. При длительном воздействии УЗ нормальная жизнедеятельность клетки может не восстановиться даже по прошествии нескольких дней после прекращения воздействия УЗ [5, 10].

В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось исследование влияния УЗ-обработки в различных жидких средах на поверхностную микрофлору мясных полуфабрикатов (МП).

Достижение указанной цели осуществлялось путем решения следующих задач:

• •    подбор штаммов МКБ, обладающих антагонистической активностью;

• •    подбор режима УЗ обработки МП;

• •    исследование качественного и количественного состава поверхностной микрофлоры до и после обработки, в процессе хранения МП;

• •    изучение влияния состава жидкой среды на поверхностную микрофлору МП.

• 1.1    Материалы и методы исследования

На первой стадии эксперимента провели отбор штаммов МКБ, обладающих антагонистической активностью. Антагонистические свойства оценивали в условиях in vitro методом лунок [14]. В работе были использованы штаммы бактерий рода L. acidophilus из коллекции лаборатории микробиологии СПб НИУ ИТМО: 5e, 7m13, H, H3, 42 .

В качестве тест-культур использовали культуры типичных для охлажденных МП микроорганизмов: Escherichia coli ( E. coli ), Pseudomonas fluorescens ( Ps. fluorescens ) и Proteus vulgaris ( P. vulgaris ) [1, 2]

Культуры ацидофильных палочек вносили в стерилизованную молочную сыворотку (МС) и термостатировали при 37 °С в течение суток. Суточные бульонные тест-культуры засевали газоном на слое агара (2,5 % МПА), после впитывания пробочным сверлом вырезали лунки диаметром 5 мм, в которые помещали по 2 капли МС с суточной культурой исследуемых штаммов L. acidophilus . Чашки Петри выдерживали в холодильнике в течение 1 ч, затем в термостате при температуре 37 ºС (чашку Петри с газоном Ps. fluorescens оставляли при комнатной температуре) в течение 24 ч и измеряли зону отсутствия роста тест-штаммов вокруг лунок в мм.

Далее провели подбор режима УЗ обработки с учетом явления кавитации, проявляющимся при распространении УЗ колебаний в жидкости.Кавитация – процесс образования и схлопывания в жидкой среде полостей, заполненных паром самой жидкости. Вследствие перепадов давления (попеременные сжатия и разряжения) наблюдаются локальные повышения температуры, нежелательные для натуральных МП (тепловая денатурация белков) [10].

Принимая во внимание объем емкости, в которой проводили обработку (500 мл), и температуру начала денатурации основного белка мышечной ткани миозина (40 ºС), установлены следующие параметры режима обработки: мощность 350 Вт (70 % от номинальной) с экспозицией 2 мин. Температура образцов мяса в процессе обработки лежала в пределах 37 ± 2 °С.

В качестве генератора УЗ применялся аппарат ультразвуковой технологический «Волна-М» УЗТА-1/22-ОРв ОМ с потребляемой мощностью до 1000 Вт и частотой 20000 Гц. Принцип его действия основан на использовании свойств УЗ колебаний высокой интенсивности в жидких и жидкодисперсных средах. Экспериментальная установка представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Экспериментальная установка для обработки УЗ

Figure 1. Experimental installation for ultrasonic treatment

На третьей стадии эксперимента изучали влияние УЗ обработки в жидких средах различного состава на поверхностную микрофлору МП. В качестве объекта исследований был выбран гуляш свиной – это мелкокусковой МП, представляющий собой кусочки мякоти массой 20-40 г с массовой долей жира до 20 %.

Для установления влияния УЗ обработки на поверхностную микрофлору МП подсчитывали число клеток микроорганизмов на 1 см2 в фиксированных окрашенных препаратах-отпечатках в 10 полях зрения до обработки и после 2 и 6 суток хранения при температуре 4 ± 2 °С. Образцы изучали с использованием оптического микроскопа «Биомед 6ПР3», оснащенного цифровой окуляр-камерой при суммарном увеличении окуляра и объектива х1000.

Обработку образцов мяса УЗ проводили в следующих жидких средах:

• •    контроль (не подвергнутый обработке УЗ);

• •    образец 1 – дистиллированная вода (рН = 6,59);

• •    образец 2 – стерилизованная МС (рН = 5,08);

• •    образец 3 – ферментированная стерилизованная МС (рН = 4,76).

• 1.2    Полученные результаты и их обсуждение

Результаты определения антагонистической активности штаммов L. acidophilus представлены в таблице 1.

Из полученных данных следует, что использованные штаммы бактерий рода L. acidophilus обладают схожей антагонистической активностью в отношении исследуемых санитарно-значимых микроорганизмов.

Высокая ингибирующая активность у всех штаммов ацидофильной палочки проявилась в отношении тест-культуры E. coli. При этом максимальная зона подавления соответствует штамму 7m13 – 18 мм, а минимальная зона штамму 5e – 11 мм.

Таблица 1.

Антагонистическая активность штаммов L. acidophilus по отношению к типичным для охлажденных МП микроорганизмам

Table 1.

Antagonistic activity of bacteria strains of L. acidophilus in relation to typical microflora representatives of chilled meat semi-finished products

Тест-культуры Test strains	Размер зон ингибирования, мм Inhibition zone, mm
	5e	7m13	H	H3	42
E. coli	11	18	17	14	15
Ps. fluorescens	13	16	10	13	12
P. vulgaris	9	13	8	11	12

Низкая эффективность штаммов ацидофильной палочки проявилась в отношении P. vulgaris . Так, максимальная зона ингибирования соответствует штамму 7m13 – 13 мм, а минимальная зона штамму H – 8 мм.

Наименьшей антагонистической активностью обладал штамм 5e, проявивший самую низкую активность из всех штаммов в отношении E. coli и P. vulgaris с размером зон ингибирования 11 и 9 мм соответственно. В отношении же Ps. fluorescens им проявлена средняя активность по сравнению с остальными штаммами, о чем свидетельствует размер зоны угнетения – 13 мм.

Наибольшую антагонистическую активность проявил штамм 7m13 с размером зон ингибирования в отношении E. coli – 18 мм, Ps. fluorescens – 16 мм и P. vulgaris – 13 мм. В связи с полученными результатами этот штамм был выбран нами для ферментирования МС и применения в дальнейших исследованиях.

Результаты изучения влияния УЗ обработки в жидких средах различного состава на поверхностную микрофлору МП представлены на рисунке 2.

Числомикробныхклеток/см2, 103

The number of bacterial cells/sm2, 103

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

до обработки (before через 2 суток через 6 суток the treatment)      хранения (after 2 хранения (after 6

days of storage) days of storage)

• ■ Контроль (control) ■ Образец 1 (sample 1) ■ Образец 2 (sample 2) ■ Образец 3 (sample 3)

Рисунок 2. Динамика численности микроорганизмов

• Figure 2.    Dynamics of microbial growth during storage

Основываясь на данных, приведенных на рисунке 2, следует отметить, что в течение первых 2 суток хранения число клеток микроорганизмов увеличилось незначительно для всех опытных образцов: контроль – число клеток увеличилось на 0,05*103, образец 1 – на 0,02*103, образец 2 – на 0,04*103, образец 3 – на 0,03*103. Очевидно, что такая задержка роста объясняется адаптацией микроорганизмов к новым условиям среды и проявлением бактерицидного эффекта обработки УЗ.

После 6 суток хранения наименьшей поверхностной обсемененностью обладал образец 3, обработанный УЗ в ферментированной штаммом L. acidophilus МС, наибольшей – образец 2, обработанный в чистой МС. Численность клеток микроорганизмов на 1 см² составила 0,22*10³ и 1,38*10³ соответственно.

Низкую бактериальную обсемененность образца 3 можно объяснить проявлением синергетического эффекта за счет совместного применения штамма 7m13 ацидофильной палочки, синтезирующей различные антимикробные вещества, и УЗ, инактивировавшего микроорганизмы.

Значительное число клеток микроорганизмов на поверхности образца 2 объясняется наличием благоприятных условий за счет обработки в МС, являющейся хорошей питательной средой для развития посторонней микрофлоры (по сравнению с обработкой в воде) с более высоким значением рН (по сравнению с ферментированной МС).

Учет микроорганизмов проводили раздельно, т.е. отдельно считали количество клеток кокков, палочек и дрожжей. Это позволило охарактеризовать микрофлору образцов также и с качественной стороны. Результаты подсчета представлены на рисунках 3 и 4.

Согласно приведенным на рисунке 3 данным поверхностная микрофлора МП во время хранения непостоянна: количественное соотношение всех групп микроорганизмов для всех опытных образцов менялось во времени. Преобладающей группой микроорганизмов на протяжении всего срока хранения являются кокковые формы, дрожжи и грамотрицательные палочки более чувствительны к воздействию УЗ. Так, через 6 суток хранения шаровидные формы составляют в контроле – 68 %, в образце 2 – 63 %, в образце 3 – 75 % от общего числа микробных клеток. Для образца 1 характерно незначительное преобладание палочек над кокками (52% к 48 %), что связано с меньшим содержанием необходимых питательных веществ в жидких средах при обработке (вода и МС).

Также, характерным для всех образцов является полное отсутствие дрожжевых клеток по окончании хранения несмотря на их присутствие после 2 суток хранения. Исключение составляет образец 3, обработанный в ферментированной МС, в составе поверхностной микрофлоры которого не было отмечено дрожжевых клеток ни до обработки, ни после 2 суток хранения.

до обработки (before the treatment)

treatment) days of storage) days of storage)

через 2 суток через 6 суток хранения (after 2 хранения (after 6 days of storage) days of storage)

■ дрожжи (yeast)                                      ■ дрожжи (yeast)

■ палочки (rod-shaped bacteria)                          ■ палочки (rod-shaped bacteria)

treatment) days of storage) days of storage)                  treatment) days of storage) days of storage)

дрожжи (yeast)

палочки (rod-shaped bacteria) кокки (cocci)

■ дрожжи (yeast)

■ палочки (rod-shaped bacteria)

■ кокки (cocci)

c

d

Рисунок 3. Качественная и количественная характеристика поверхностной микрофлоры опытных образцов: a – контроль; b – образец 1; c – образец 2; d – образец 3

• Figure 3.    The quantitative and qualitative composition of the surface microflora of the check samples:a – control; b – sample 1; c – sample 2; d – sample 3

Приведенные на рисунке 4 микроскопические фотографии наглядно демонстрируют неоднородность поверхностной микрофлоры опытных образцов МП после 6 суток хранения.

Такая неоднородность связана, во-первых, с различием состава жидких сред, в которых проводилась обработка УЗ, и, во-вторых, с различной устойчивостью бактерий к действию УЗ.

a

b

c

d

Рисунок 4. Микроскопические фотографии фиксированных окрашенных препаратов-отпечатков поверхности экспериментальных образцов после 6 суток хранения:a – контроль; b – образец 1; c – образец 2; d – образец 3

Figure 4. Microscope photos of heat-fixed and stainedtouch smearsof surfaceof the check samples after 6 days of storage: a – control; b – sample 1; c – sample 2; d – sample 3

Выводы

Анализируя результаты исследований можно заключить следующее:

• •    в ходе проведенных исследований был отобран штамм бактерий рода L. acidophilus 7m13 , проявивший лучшую антагонистическую активность по отношению к использованным тест-культурам бактерий;

• •    установлены следующие параметры режима УЗ-обработки: мощность 350 Вт с экспозицией 2 мин, что не приводит к денатураци-онным изменениям белков мышечной ткани;