Исследование воздействия хлорида кадмия на некоторые маркерные ферменты печени экспериментальных животных

В связи с быстрым ростом численности населения планеты антропогенное загрязнение окружающей среды тяжёлыми металлами является ключевым фактором в формировании большинства экологических проблем [1–3]. Наряду с пестицидами, ядохимикатами, фармацевтическими препаратами и новыми химическими веществами тяжёлые металлы при трансформации в биосфере создают постоянно нарастающий «химический прессинг» [4, 5]. В последние годы тяжёлые металлы относят к приоритетным экотоксикантам, так как их присутствие выявлено в составе практически всех природных сред. Кроме того, тяжёлые металлы включаются в пищевые цепи и депонируются в организме животных и человека, даже в незначительных количествах оказывая влияние на процессы жизнедеятельности биологических систем. В основе токсического действия тяжёлых металлов на живой организм лежит повреждение клеток и их органелл, сопровождающееся функциональными, либо структурно-функциональными изменениями [6].

Кадмий (Cd) является одним из наиболее мощных и опасных тяжёлых металлов. Производство, потребление и выбросы кадмия в атмосферу, наземную и водную среду постоянно увеличиваются ввиду его широкого применения в различных антропогенных и промышленных видах деятельности [7, 8]. Cd не выводится из организма и не разлагается; оказывает выраженное кумулятивное действие на ткани по причине длительного биологического периода полураспада (20 лет) [9, 10]. Воздействие Cd связано с полиорганным повреждением, прежде всего, поражением печени, почек, головного мозга, лёгких, сердца, костного мозга, как у животных, так и у человека [11].

Печень играет важную роль в сохранении гомеостатического равновесия в живых организмах [12]. Ведущую роль гепатоцитов в регуляции состава внутри- и внеклеточных жидкостей, активности и направленности метаболических процессов определяет тот факт, что печень является основным органом депонирования токсических элементов. Поэтому кадмий, попадая в биосистемы, накапливается в органе-мишени, инициируя изме- нение морфофункционального состояния клеток печени [13, 14]. Моделирование повреждений печени является важным направлением токсикологии в диагностическом, терапевтическом и других аспектах, поскольку позволяет оценить глубину повреждения органа-мишени и открывает возможности для разработки критериев ранней диагностики гепатопатологических состояний.

Один из механизмов токсичности Cd заключается в нарушении антиоксидантной системы организма, что способствует окислительному стрессу и перекисному окислению липидов, приводящим к изменению биохимических функций печени [15–17]. Предполагается, что кадмий обладает способностью связываться с SH-группами белковых молекул и таким образом ингибировать каталитическую активность ключевых ферментных систем, влияя на многие процессы, протекающие в живом организме. Кроме того, кадмий может замещать многие минеральные элементы (кальций, цинк, железо и т.д.) в составе большинства энзимов, что отражается на химических свойствах и метаболизме, а также взаимодействовать с компонентами клеточных мембран, нарушая структуру. Повреждающее воздействие кадмия приводит к формированию существенных отклонений от нормы в составе крови живых систем [18].

Изменение активности ряда ферментов считается высокочувствительным индикатором отдельных заболеваний, поражений органов и тканей [19]. В частности, по мнению ряда исследователей, критерии диагностики заболеваний печени токсической природы должны основываться на изучении ранних биохимических, функциональных сдвигов, предшествующих выявлению отчётливых клинических симптомов [20–22]. Маркеры гепатотоксичности позволяют оценить степень влияния хронической интоксикации кадмием и сделать вывод о функциональной целостности печени [23– 25]. Так аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) являются чувствительными индикаторами повреждения гепатоцитов, вызванного токсикантами. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) представляет собой фермент, играющий важную роль в общем метаболизме организма и оказывающий существенное влияние на окис- лительно-восстановительный потенциал клетки [26]. Изменение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), показателя холестаза, указывает на мембраноповреждающий эффект гепатотоксиканта. При воздействии кадмия на орган-мишень в результате нарушения метаболических процессов на уровне клетки и субклеточных структур происходит изменение целостности гепатоцитов, в результате чего отмечается выброс данных энзимов в межклеточное пространство [27, 28].

Выбор продолжительности эксперимента при рассмотрении токсических свойств анализируемого вещества определяется задачами исследования. Как правило, токсикологический потенциал химических веществ изучается в следующей последовательности: острый эксперимент → подострый эксперимент → субхронический эксперимент → хронический эксперимент.

Исследования воздействия токсичных металлов на организм в отделе токсикологии и генетики с экспериментальной клиникой лабораторных животных ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» проводятся в течение нескольких лет. Ранее, в ходе экспериментов острого и подострого характера по изучению токсического влияния хлорида кадмия на живые системы, нами были установлены безвредные, токсические, летальные дозы вещества; определены допустимые условия воздействия, оптимальные суточные дозы для проведения субхронических и хронических исследований.

В научной литературе, в большинстве случаев, отражены данные о биохимических показателях в отношении линейных животных в зависимости от линий, возраста, пола, свободы от патогенной флоры и др., в то время как у беспородных такого рода сведения носят ограниченный характер. Кроме того, недостаточно изучены процессы восстановления функциональной целостности органов-мишеней после прекращения поступления кадмия в организм (так называемая стадия ремиссии) с многообразными адаптивными механизмами живых систем.

В связи с вышеизложенным основная цель настоящей работы заключалась в оценке изменений активности ферментов-маркеров гепатотоксично- сти, в частности, АСТ, АЛТ, ЛДГ и ЩФ в сыворотке крови лабораторных животных после перорального воздействия водного раствора хлорида кадмия (CdCl2) в условиях субхронической модели эксперимента с периодом ремиссии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 40 белых аутбред-ных крысах со средней массой тела 200 г. Животные содержались в стандартных условиях экспериментальной клиники лабораторных животных ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», характеризующихся постоянством комнатной температуры (20–25 °C) и уровня влажности (30–70%), с 12-часовым искусственным освещением (с 08:00 до 20:00). В начале эксперимента животные методом случайной выборки были разделены на 4 группы по 10 особей (5 самцов и 5 самок) в каждой: контрольная группа (К) и 3 экспериментальные группы. Для оценки токсического действия поллютанта животным экспериментальных групп 1–3 ежедневно в течение 3 месяцев перорально вводили водный раствор хлорида кадмия. Условия содержания и кормления были одинаковы для всех групп животных. Дизайн исследования представлен в таблице 1.

Дизайн исследования

Таблица 1

Группа	Контрольное вещество, токсикант	Доза вводимого вещества, мкг/кг
Контроль	Дистиллированная вода	Эквиобъемно
1	CdCl2	1
2	CdCl2	10
3	CdCl2	100

По окончании введения токсиканта животные проходили стадию ремиссии в течении 1 месяца. В данный период крысы имели свободный доступ к корму и питьевой воде в течение суток, пероральные манипуляции были прекращены. Далее

Методы определения биохимических показателей в эксперименте

Таблица 2

№	Биохимический показатель	Метод определения
1	АСТ	Кинетический УФ без пиридоксальфосфата (IFCC)
2	АЛТ	Кинетический УФ без пиридоксальфосфата (IFCC)
3	ЛДГ	Кинетический УФ
4	ЩФ	Кинетический (DGKC)

Изменения биохимических показателей у экспериментальных животных в зависимости от дозы воздействия хлорида кадмия

Таблица 3

Показатели	Группа животных
	Контроль	1	2	3
АСТ, Ед/л	154,75 [119,38; 173,4]	225,7 [179,78; 288,1]*	186 [160,25; 221,45]	170,3 [134,23; 227,2]
АЛТ, Ед/л	51,05 [42,6; 58,18]	56,05 [52,4; 69,68]	60,3 [46,15; 64,3]	48,5 [44,9; 52,95]
ЛДГ, Ед/л	1470 [1268,5; 1746]	1603 [1531,5; 1636,25]	1507,5 [1224,5; 1556,75]	1559 [1095,5; 1798,5]
ЩФ, Ед/л	216,7 [151,75; 243,25]	163,2 [153,4; 199,38]	135,45 [122,1; 192,5]	96,6 [59,55; 141,75]*

Примечание: * — статистически значимая разница между животными группы К- и 1, 2, 3; р<0,05

животные выводились из эксперимента с помощью углекислого газа, после чего производился забор образцов крови для биохимических исследований. Оценивали функциональное состояние печени, что включало определение активности в сыворотке крови АСТ, АЛТ, ЛДГ, ЩФ.

Все манипуляции осуществляли, соблюдая правила, изложенные в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Strasbourg, 1986).

Уровни биохимических показателей были проанализированы с помощью наборов реагентов «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, Россия) (таблица 2) на анализаторе «Stat Fax 3300» («Awareness Technology», США) в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения IBM SPSS

Statistics 21 (IBM, США). Анализ экспериментальных данных проводили с помощью H-критерия Краскала–Уоллиса для попарного сравнения групп. Результаты выражали в виде Me [Q1; Q3], где Me — медиана, Q1–1-й квартиль, Q3–3-й квартиль. Критический уровень значимости (p) принят равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты проведённых биохимических исследований представлены в таблице 3.

Уровень активности АСТ в сыворотке крови лабораторных крыс между группами статистически значимо отличался (H=11,18; р=0,011) (рис. 1). При пероральном введении хлорида кадмия в экспериментальной группе 1 наблюдалось увеличение активности фермента на 45,9% относительно контроля (р=0,006). В группах 2 и 3 было отмечено повышение активности трансаминазы на 20,2% и 10,1%, соответственно.

Доза CdCl2, мкг/кг

Рисунок 1. Изменение активности АСТ в зависимости от дозы воздействия хлорида кадмия в условиях субхронической модели эксперимента с периодом ремиссии

Идентичное явление представляло собой повышение концентрации АЛТ в опытных группах животных 1 и 2 — на 9,8% и 18,1%, соответственно, относительно отрицательного контроля. Однако, эти изменения не достигали уровня статистической значимости (H=6,36; р=0,095). В то же время, в группе 3 было выявлено некоторое понижение содержания фермента, а именно на 5,0% (рис. 2).

Доза CdCl2, мкг/кг

Рисунок 2. Изменение активности АЛТ в зависимости от дозы воздействия хлорида кадмия в условиях субхронической модели эксперимента с периодом ремиссии

В настоящем исследовании определялось увеличение активности ЛДГ на 9,1% в группе 1, на 2,6% и 6,1% в группах 2 и 3, соответственно, относительного контрольной группы (рис. 3).

При анализе медианных значений активности ЩФ в экспериментальных группах установлены различия, статистически значимые по сравнению

Доза CdCl2, мкг/кг

Рисунок 3. Изменение активности ЛДГ в зависимости от дозы воздействия хлорида кадмия в условиях субхронической модели эксперимента с периодом ремиссии с контролем (H=15,55; р=0,001) (рис. 4). Выявлено дозозависимое уменьшение уровня активности ЩФ в группах животных 1, 2 и 3 относительно контроля, на 24,7%, 37,5% и 55,4% (р=0,002), соответственно.

Доза CdCl2, мкг/кг

Рисунок 4. Изменение активности ЩФ в зависимости от дозы воздействия хлорида кадмия в условиях субхронической модели эксперимента с периодом ремиссии

ОБСУЖДЕНИЕ

Характерно, что для оценки степени нарушения функционально-метаболического статуса органов-мишеней при интоксикации тяжёлыми металлами экспериментальных животных традиционно регистрируются изменения активности ключевых ферментов-маркеров. Так, при диагностике патологии печени наиболее часто определяют уровень аминотрансфераз. Данные каталитические белки характеризуются специфическим распределением в клетке: АСТ сосредоточена в основном в митохондриях, а АЛТ — в цитоплазме [29, 30].

Согласно полученным данным, можно предположить, что при субхроническом воздействии CdCl2 на экспериментальных животных происходит разрушение клеточных мембран гепатоцитов, в том числе уже при низкой дозе токсиканта (1 мкг/кг). В то же время, благодаря высокой реакционной способности, тяжёлые металлы способны ингибировать ферментативную активность, вызывая нарушения биосинтетических процессов [31]. Результаты согласуются с ранее опубликованными выводами [32, 33].

ЛДГ является цинксодержащим ферментом и отражает степень выраженности внутритканевой гипоксии [34]. На наш взгляд, индуцированный ионами Cd2+ рост концентрации лактатдегидрогеназы в крови экспериментальных животных свидетельствует о повышении доли бескислородного гликолиза. Известно, что данный процесс сопровождается увеличением концентрации продуктов гликолитических реакций — молочной и пировиноградной кислоты, а также развитием некомпенсированного метаболического ацидоза.

В совокупности с тенденцией к повышению активности аминотрансфераз и ЛДГ снижение концентрации ЩФ в группах крыс, подвергшихся пероральному воздействию хлорида кадмия, может указывать на повреждение печени, нарушение секреторной функции органа-мишени и свидетельствовать о патологических процессах в гепатоцитах.

Существует общее мнение, что окислительный стресс, воспаление и апоптоз играют решающую роль в патогенезе кадмий-индуцированной гепатотоксичности [35]. Негативное действие кадмия заключается в окислительном повреждении клеточных органелл за счёт выработки активных форм кислорода (АФК), таких как пероксиды и гидрок-сид-ионы. В то же время окислительный стресс при внутриклеточном накоплении тяжёлого металла приводит к формированию гепатоцеллюлярной травмы, включающей вытеснение активных окислительно-восстановительных металлов, истощение окислительно-восстановительных поглотителей, ингибирование антиоксидантных ферментов и цепи переноса электронов, а также поврежде- ние митохондрий [36]. Помимо этого, токсическое действие ионов Cd2+, с высоким сродством к цистеину, обусловлено их связыванием с биологическими молекулами, имеющими в составе тиоловые группы, такими как металлотионеины и восстановленный глутатион [37, 38]. Данные негативные изменения способствуют нарушению структуры фосфолипидов биологических мембран и приводят к повреждениям белков и ДНК. Далее, на фоне нарушения баланса процессов репарации АФК-опосредованный стресс индуцирует апоптоз или некроз поражённых клеток печени [39].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, кадмий является высокотоксичным тяжёлым металлом, который может вызывать значительные изменения в биохимических параметрах крови, так как способен генерировать свободные радикалы с достаточно высокой скоростью, чтобы подавлять естественную систему антиоксидантной защиты организма. В ходе нашего исследования показано, что в условиях субхронической модели эксперимента с периодом ремиссии кадмий, обладая выраженным гепатотоксическим действием, индуцирует повреждение печени. Установлено, что пероральное введение лабораторным животным водного раствора CdCl2 даже при минимальной дозе (1 мкг/кг) сопряжено с изменением проницаемости клеточных мембран гепатоцитов и нарушением биосинтетических процессов в печени, что проявляется значительным повышением активности АСТ, АЛТ, ЛДГ и дозозависимым снижением ЩФ в сыворотке крови. Полученные в настоящей работе результаты расширяют традиционные представления о различных механизмах действия тяжёлых металлов на биоэнергетический метаболизм клеток органов-мишеней.

Финансирование: Работа проведена за счёт средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках отраслевой научноисследовательской программы Роспотребнадзора на 2021–2025 гг. «Научное обоснование национальной системы обеспечения санитарноэпидемиологического благополучия, управления рисками здоровью и повышения качества жизни населения России», п. 6.1.9 «Экспериментальное обоснование высокочувствительных маркеров воздействия токсичных металлов на организм и разработка мер профилактики», регистрационный номер: 121062100057–1.

Соответствие принципам этики. Согласно выписке из протокола заседания биоэтической комиссии ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», от 03.04.2023 № 01–04, проведённые исследования выполнены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей, и могут быть опубликованы.