Исследование возможности использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья гречихи посевной

В настоящее время основным источником получения рутина являются бутоны софоры японской, однако в Российской Федерации отсутствует промышленная сырьевая база данного растения, поэтому потребность в этом ценном флавоноидном ангиопротекторе удовлетворяется за счет импорта. Перспективным источником получения рутина является гречиха посевная ( Fagopy-rum sagittatum Gilib.), широко культивируемая в Самарской области и в РФ в целом. Важнейшим направлением по обоснованию целесообразности использования сырья гречихи посевной является проведение фармакогностических, химико-технологических и аналитических исследований надземной части данного растения. Принимая во внимание то обстоятельство, что до сих пор в литературных источниках и нормативной документации на рутин не сложились единые подходы к анализу, как травы гречихи посевной, так и рутина, представляется актуальным исследование по выбору оптимальных методов анализа сырья данного растения и лекарственной субстанции «Рутин». Одним из селективных методов анализа биологически активных веществ, в том числе флавоноидов, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Особенностью данного метода является возможность использования его одновременно как в качественном, так и в количественном анализе.

Анисимова Мария Михайловна, аспирантка

Цель работы: исследование по разработке методик качественного и количественного анализа нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» с применением ВЭЖХ.

Материал и методы. Исследовали образцы надземной части гречихи посевной, культивируемой в Самарской области, а именно: СреднеВолжский филиал ГУ ВИЛАР (пос. Антоновка), Самарский ботанический сад. Образцы сырья собирали в фазу цветения в 2009 г. Исследовали также образцы субстанции «Рутин», полученные из травы гречихи посевной в лабораторных условиях. В ходе разработки методик качественного и количественного анализа нами анализировалось водно-спиртовое извлечение травы гречихи посевной. При этом было предложено использование в данных методиках государственного стандартного образца (ГСО) рутина.

ВЭЖХ-анализ осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе “Мили-хром-5” в изократическом режиме (колонка КАХ 6-80-4 № 6 25.01.99, стационарная фаза - “Sepa-ron C 18 ”. Подвижной фазой в анализе служила смесь ацетонитрила и воды в различных соотношениях с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты. Скорость хроматографирования в аннализе составляла 0,1 мл/мин, объем вводимой пробы – 5 мкл. Детекцию флавоноидных структур проводили при аналитической длине волны λ max 360 нм. Для обнаружения возможных сопутствующих веществ использовали дополнительные длины волн: 254; 270; 290; 330 нм.

Результаты и их обсуждение. При выборе аналитической длины волны мы руковод-ствовались данными спектрофотометрических исследований. УФ-спектр рутина имеет 2 макси-мума поглощения при 256 нм и 362 нм (рис. 1). Поскольку в коротковолновой области обнаруживаются многие фенольные соединения, то наиболее специфичной для анализа рутина в траве гречихи посевной будет длина волны 360 нм с учетом технических возможностей хроматографа (диапазон детектирования 210-360 нм). Спектрофотометрическая методика не позволяет избирательно определять целевое вещество (рутин) в смеси флавоноидных соединений, содержащихся в траве гречихи посевной. Поэтому для решения данной задачи был выбран метод ВЭЖХ, который использован нами для обоснования способа получения рутина.

Рис. 1. УФ-спектр раствора рутина

В результате проведенных технологических исследований разработан способ получения рутина. Выход рутина составляет около 1,5-2,0% от массы воздушно-сухого сырья. На начальном этапе нами были проведены ВЭЖХ-исследо-вания полученного образца рутина по подбору оптимальных условий хроматографирования. По результатам ВЭЖХ-анализа образца рутина, полученного из травы гречихи, выявлено присутствие примесного пика с временем удерживания 1,913 мин (рис. 2).

Рис. 2. Хроматограмма образца рутина

Аналогично образцу рутина нами проанализирована трава гречихи посевной. При ВЭЖХ-анализе травы использовали извлечение на 70% спирте этиловом в соотношении 1:1000 (рис. 3). По результатам ВЭЖХ исследований подобраны оптимальные условия хроматографирования, в частности, состав подвижной фазы, представленный ацетонитрилом и водой в соотношении 3:7 с добавлением 1% уксусной кислоты. За аналитическую длину волны приняли λmax = 360 нм.

Рис. 3. Хроматограмма водно-спиртового извлечения из травы гречихи посевной

Методика количественного определения рутина в траве гречихи посевной . Около 1 г (точная навеска) воздушно-сухого образца измельченного сырья с размером частиц, проходящих через сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в колбу с притертой крышкой емкостью 100 мл, добавляют 40 мл 70% этилового спирта. Колбу взвешивают на тарирных весах с точностью до ± 0,01 г и присоединяют к обратному холодильнику. Экстракцию осуществляют при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение охлаждают, доводят на та-рирных весах до первоначальной массы 70% этиловым спиртом и отфильтровывают через бумажный фильтр с красной полосой. 1 мл полученного извлечения (1:40) переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А). 5 мкл раствора А вводят в хроматограф «Милихром-5» и хроматографируют со скоростью потока 0,1 мл/мин. Детекцию анализируемых веществ проводят при аналитической длине волны λ max 360 нм. Анализ осуществляют в трех повторностях. Параллельно осуществляют анализ раствора А РСО рутина при длине волны 360 нм. Содержание рутина в процентах (Х) вычисляют по формуле:

Х =

H X m 0 X 2000

H ₀ x m

где H – значение высоты флавоноидного пика (пик 2 рис. 3) рутина испытуемого раствора; H 0 – высота пика раствора РСО рутина; m – объём аликвоты, г; m 0 – масса РСО рутина, г.

Содержание рутина в траве гречихи посевной находится в диапазоне 2,50-3,70% в зависимости от года сбора и места культивирования.

Примечание: Приготовление раствора государственого стандартного образца рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После растворения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А).

Таким образом, обоснована целесообразность возможности использования метода ВЭЖХ в качественном и количественном анализе травы гречихи посевной и субстанции «Рутин». При этом присутствие доминирующего пика рутина (пик 2, рис. 3) является аналитическим эффектом, указывающим на подлинность сырья.

Выводы:

• 1.    Предложен новый вид лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» как перспективный источник флавоноидов, в том числе рутина.

• 2.    Разработаны методики качественного и количественного определения рутина в траве гречихе посевной с использованием ВЭЖХ;

• 3.    Разработана методика ВЭЖХ-анализа субстанции «Рутин».