Исследование взаимодействия штаммов B. subtilis и Tr. harzianumи патогенных микроорганизмов - возбудителей заболеваний кабачков

Введение. По данным продовольственной и Потери выращенных кабачков на стадиях их сельскохозяйственной организации ООН – Food and Agriculture Organization (FAO), потери, связанные с заболеваниями и снижением качества сельскохозяйственной продукции в процессе хранения, составляют 30–40 %. Согласно данным за 2021 г., экономические потери от заболеваний продукции растениеводства превышают 220 млрд долларов США в год [1]. Опасность заболеваний сельскохозяйственных культур выражается не только в гибели растений или потерях урожая, но и в снижении его качества из-за загрязнения сельскохозяйственной продукции токсинами бактериального и грибного происхождения.

Кабачки – популярная овощная культура, отличающаяся ранним формированием урожая, ценными диетическими свойствами при высокой урожайности и являющаяся неотъемлемой составляющей рационов питания населения Российской Федерации. Кроме того, кабачки в значительных количествах используются в перерабатывающей промышленности.

сортирования, транспортирования, хранения и реализации составляют в среднем 35–40 %.

Причиной потерь чаще всего является микробиологическая порча, для предотвращения которой необходимо учитывать ряд факторов: адаптацию возбудителей микробиологических заболеваний к традиционным средствам защиты, увеличение их активности, расширение видовой структуры и ареала; различный характер взаимодействия штаммов-продуцентов биологических препаратов и патогенных микроорганизмов в зависимости от вида растительного объекта в процессе хранения; снижение адаптивного потенциала объектов хранения к воздействию патогенных микроорганизмов филло-сферы [2].

В связи с этим актуально исследование процессов развития и взаимодействия штаммов-продуцентов известных биологических препаратов и патогенных микроорганизмов (бактериальной и грибковой природы), обеспечивающих снижение потерь от микробиологической порчи овощей для совершенствования сущест- вующих и разработки новых технологий хранения.

Цель исследования – выявление эффективных видов и форм применения микроорганизмов-антагонистов для предотвращения развития характерных заболеваний, вызывающих порчу кабачков, для их дальнейшего применения при разработке технологий биологического контроля.

Задачи: сравнить обсемененность филло-сферы кабачков различных сортов, выращенных в Темрюкском районе Краснодарского края, характерными группами патогенной микрофлоры; установить свойства известных микроорганизмов-антагонистов B. subtilis штамм ИПМ 215, B. subtilis штамм М-22 ВИЗР, Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР по отношению к распространенным фитопатогенам.

Объекты и методы. Объектами исследования являлись кабачки Марселла F1, СА7585, Даша F1, Невира F1, Ясна F1, Донья Перфекта F1, выращенные в 2022 г. в Краснодарском крае (Темрюкский район, ИП Ерохин); микроорганизмы-антагонисты B. subtilis штамм ИПМ 215, B. subtilis штамм М-22 ВИЗР, Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР; плесневые грибы Alternaria radicina и Fusarium culmorum и бактерия Pectobacterium carotovora.

Микробиологические исследования проводились в соответствии со стандартами [3–7] и по методикам, разработанным авторами. Фитопатологические исследования проводили с использованием методов визуальной диагностики, биометрии и микроскопии с помощью микроскопа Axioimager Z2.

При исследовании свойств микроорганизмов-антагонистов к возбудителям бактериальных и грибковых заболеваний кабачков в качестве тестовых микроорганизмов-антагонистов были подобраны культуры бактерий рода Bacillus и почвенного гриба рода Trichoderma: бактерии Bacillus subtilis штамм ИПМ 215 и штамм М-22 ВИЗР, гриб Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР [8–12].

Идентификация культур проводилась с помощью стандартных определителей и вспомогательной литературы [13–21].

Проверку антагонистических свойств выбранных культур проводили по отношению к основным установленным возбудителям бактериальных и грибковых заболеваний кабачков. Для предотвращения перезаселения плодов микроорганизмами-антагонистами был выбран способ обработки искусственно зараженных кабачков культуральной жидкостью (КЖ) исследуемых микроорганизмов-антагонистов.

Для проведения исследований микроорганизмы-антагонисты выращивались на жидкой питательной среде МПБ в течение 48 ч при температуре 27±1 °С, затем клетки микроорганизмов вместе с питательной средой центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин для их осаждения. Далее отбирали кабачки без видимых поражений, промывали водопроводной водой и нарезали ломтиками толщиной 5–7 мм; ломтики кабачков дважды промывали в этиловом спирте, затем в стерильной воде. В каждую стерильную чашку Петри на фильтровальную бумагу помещали ломтик кабачков. Для принудительного заражения использовали плесневые грибы Alter-naria radicina и Fusarium culmorum и бактерию Pectobacterium carotovora . Культуральную жидкость микроорганизмов-антагонистов и суспензию микроорганизмов-патогенов вносили по 1 капле. Эксперимент проводился в трехкратной повторности. Контроль активности культур-антагонистов в отношении фитопатогенов производили через 7 и 14 дней хранения при температуре 23±2 °С, определяли поражение поверхности дисков кабачков.

Результаты и их обсуждение. Поскольку каждый из органов растений представляет особую эконишу по отношению к распространенным на нем микроорганизмам, определяли микрофлору с поверхности филлосферы, а именно с филлоплана (поверхности листьев) и карпосфе-ры (поверхность плодов) [2]. Был проведен количественный подсчет и анализ состава микробных сообществ филлосферы кабачков (табл. 1).

Таблица 1

Сорт	Количество микроорганизмов, КОЕ/г
	Микроорганизмы филлоплана			Микроорганизмы карпосферы
	МАФАнМ	Дрожжи	Плесени	МАФАнМ	Дрожжи	Плесени
СА7585	9·102	12·102	85·102	41·102	11·102	32·102
Даша F1	12·103	12·102	19·103	31·102	10·102	11·103
Невира F1	2·103	9·102	29·102	32·102	9·102	7·103
Ясна F1	5·102	9·102	54·102	27·102	10·102	27·102
Донья Перфекта F1	6·103	14·102	47·102	43·102	8·102	10·103
Марселла F1	15·103	22·102	20·103	59·102	12·102	13·103

Сравнение обсемененности филлосферы кабачков различных сортов, выращенных в Темрюкском районе Краснодарского края

На основании исследований было установлено, что сорта Даша F1, Невира F1, Донья Перфекта F1 и Марселла F1 в большей степени подвержены патогенным плесневым и бактериальным заболеваниям. У сортов Даша F1 и Марселла F1 плесневыми микроорганизмами поражаются и листья, и плоды, у сорта Невира F1 и Донья Перфекта F1 – плоды.

Сорта СА7585 и Ясна F1 подвержены плесневым и бактериальным заболеваниям в меньшей степени, листья при этом поражены в большей степени плесневыми микроорганизмами, плоды – бактериальными.

Можно также отметить, что сорт Ясна F1 был поражен фитопатогенными микроорганизмами меньше других, а сорт Марселла F1 оказался наиболее уязвимым к поражению патогенными микроорганизмами.

На исследуемых частях растений всех сортов обнаружено 2 постоянно присутствующих вида плесневых микроорганизмов – Alternaria radicina и Fusarium culmorum . Они известны как потенциальные производители микотоксинов, являющихся биологическими контаминантами (природными загрязнителями) [22–26].

Наиболее распространенный вид патогенной бактерии на всех исследуемых сортах – Peсtobacterium (Erwinia) carotovorum sub sp. (визуально проявляется в виде прозрачных пятен и потрескавшейся кожицы).

Для изучения влияния различных микроорганизмов-антагонистов на фитопатогены, вызывающие заболевания кабачков, использовались микроорганизмы-антагонисты: B. subtilis штамм ИПМ 215; B. subtilis штамм М-22 ВИЗР; Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР.

Известно, что штаммы-антагонисты образуют при культивировании зоны подавления роста и развития культур патогенов, выделяя в среду вещества, ингибирующие развитие конкурирующих с ними патогенов. Подавление роста обусловлено продуцированием антагонистами продуктов обмена в виде перекиси водорода, летучих кислот, эфиров, ферментов, антибиотиков, сидерофоров и других биологически активных соединений, действующих на биологические объекты, в частности на фитопатогены [27–32].

Проверку антагонистических свойств выбранных культур проводили на кабачках сорта Марселла F1 по отношению к основным возбудителям бактериальных ( Pectobacterium caroto-vora) и грибковых ( Alternaria radicina и Fusarium culmorum) заболеваний кабачков (табл. 2).

Диски кабачков, принудительно зараженные и обработанные КЖ микроорганизмов-антагонистов и без обработки, через 14 дней хранения при температуре 23 ± 2 °С представлены на рисунке 1.

Таблица 2

Вариант опыта		Поражение поверхности диска, % Срок хранения
Обработка КЖ антагонистов	Инфицирование	7 сут	14 сут
Контроль (без заражения)	Контроль (без инфицирования)	50,0	85,0
B.subtilis штамм ИПМ 215	Pectobacterium carotovora	35,0	50,0
B.subtilis штамм ИПМ 215	Alternaria radicina	45,0	70,0
B.subtilis штамм ИПМ 215	Fusarium culmorum	40,0	70,0
B.subtilis штамм М-22 ВИЗР	Pectobacterium carotovora	12,0	20,0
B.subtilis штамм М-22 ВИЗР	Alternaria radicina	35,0	60,0
B.subtilis штамм М-22 ВИЗР	Fusarium culmorum	20,0	50,0
Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР	Pectobacterium carotovora	2,0	5,0
Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР	Alternaria radicina	10,0	20,0
Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР	Fusarium culmorum	2,0	10,0

Активность культур-антагонистов в отношении фитопатогенов кабачков

Рис. 1. Активность культур-антагонистов в отношении фитопатогенов после 14 сут культивирования: А – контроль (без обработки КЖ микроорганизмов-антагонистов); В – обработка КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215; С – обработка КЖ B. subtilis штамм М-22 ВИЗР; D – обработка КЖ Tr. harzianum штамм Г 30 ВИЗР; 1 – с инфицированием Pectobacterium carotovora;

2 – с инфицированием Fusarium culmorum; 3 – с инфицированием Alternaria radicina

Образцы кабачков, не обработанных КЖ, и пространство на фильтровальной бумаге вокруг них через 14 сут были поражены неидентифи-цированными бактериями и плесенями с мицелием серо-зеленого цвета в среднем на 85 % (рис. 1, А).

В результате исследований наилучшие результаты показала обработка дисков кабачков КЖ Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР по отношению ко всем исследуемым фитопатогенам грибковой ( Alternaria radicina и Fusarium culmorum ) и бактериальной природы ( Pectobac-terium carotovora ).

Установленная эффективность биологического контроля фитопатогенов с использованием Trichoderma spp . обуславливается способностью триходермы к синтезу ряда вторичных метаболитов с высокой, установленной ранее проведенными исследованиями [33], антибиотической активностью (пептаиболы, поликетиды и терпены).

На образцах кабачков, обработанных КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215, уже на четвертые сутки хранения развились признаки порчи (размягчение и побурение поверхности образцов). Можно утверждать, что обработка кабачков КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215 для защиты кабачков от фитопатогенов при хранении не является целесообразной.

Бактерии B. subtilis штамм М-22 ВИЗР проявляют незначительный антагонистический эффект по отношению к Alternaria radicina (рис. 1, С-3).

Заключение. Изучен состав филлосферы кабачков, выращенных в мае-июле 2022 г. в хозяйстве ИП «Ерохин Александр Александрович» (Темрюкский район, Краснодарский край). Установлено, что у разных сортов кабачков состав филосферы изменяется мало. Отличия обнаруживаются в количественном соотношении между отдельными группами микроорганизмов, а не в их качественном составе. Характерными представителями микрофлоры кабачков, выращиваемых в Темрюкском районе Краснодарского края, являются бактерии родов Agrobacterium, Bacillus, Clavibacter, Pectobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas , дрожжи рода Zygosaccharomyces, плесневые грибы рода

Colletotrichum и грибы Alternaria radicina и Fusarium culmorum.

Изучено взаимодействие B. subtilis штамм ИПМ 215, B. subtilis штамм М-22 ВИЗР; Tr. harzianum штамм Г 30 ВИЗР и патогенных микроорганизмов Alternaria radicina, Fusarium culmorum и Pectobacterium carotovora . Установлено, что обработка КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215 принудительно зараженных кабачков позволяет снизить поражение в среднем на 15– 35 % в сравнении с контрольными образами; обработка КЖ B. subtilis штамм М-22 ВИЗР – на 25–65 %; обработка КЖ Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР – на 65–80 %.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно предположить эффективность использования культуральной жидкости клеток плесневых грибов Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР для дальнейших исследований по разработке технологий хранения овощей.