Исследование жизнеспособности и фенотипических свойств штаммов возбудителя инфекционной агалактии овец и коз

Бактерия Mycoplasma agalactiae впервые была выделена у овец и коз, и является возбудителем инфекционной ага-лактии [14]. Инфекционная агалактия овец и коз – контагиозная болезнь, характеризующаяся поражением вымени (маститы), суставов (артриты, полиартриты), глаз (ке-ратоконьюнктивиты), в редких случаях является причиной пневмонии и абортов [11, 13].

Кроме того, данное заболевание может быть вызвано видами М.capricolum и M.mycoides, а также их подвидами , M.purtrfaciens и сapri, относящихся к роду Mycoplasma, и проявляются такими симптомами, как маститы, пневмония и артриты.

Aгалактия овец и коз встречается в Европе, Азии и Африке, особенно в странах по берегам Среднеземного моря (Ис- пании, Италии, Франции, Швейцарии, Румынии и прочее [9, 12, 15]. Анализ литературных источников показал, что в 20012002 гг. в штате Параиба (Восточная Бразилия) было выявлено 2 случая контагиозной агалактии овец и коз, вызванной M.agalactiae [11]. На территории Монголии за период 2003-2012 гг. зарегистрированы случаи возникновения заболевания в 6929 неблагополучных пунктах [1]. В бывшем Советском Союзе данное заболевание было зарегистрировано в Азербайджане в 1936 году, затем в 1943 в Армении, в Грузии в 1946. В последующем болезнь была установлена в Киргизии и ряде других республик Средней Азии.

Овцеводство как отрасль сельского хозяйства в России и за рубежом является одним из видов традиционной фермерской деятельности, и играет важную роль в решении продовольственной программы по обеспечению населения высококачественной бараниной, шерстью, овчиной и молоком [2]. С расширением экономических и торговых связей между государствами и внутри страны, существенно повышается риск возникновения случаев инфекционной агалактии овец и коз в регионах с традиционным ведением овцеводства: Южный и Северо-Кавказский федеральные округа (Дагестан, Республика Калмыкия, Ставропольский край, Астраханская область, Карачаево-Черкессия), а также Ростовская область, Республика Тыва, Волгоградская область, Башкортостан, Республики Алтай и Татарстан [3, 10].

Заболевание наносит хозяйствам значительный экономический ущерб в результате падежа и вынужденного убоя заболевших животных, снижения молочной и шерстной продуктивности, высокого процента выбраковки овец и коз [11]. Во время эпизоотии потеря молочной продуктивности нередко достигает 60 %. При этом во многих случаях у переболевших животных молочная продуктивность не восстанавливается. Несмотря на то, что заболевание не всегда сопровождается высокой смертностью, вынужденный убой и выбраковка переболевших животных нередко составляет 25-30 % и более.

Успех профилактики и ликвидации инфекционных болезней, в том числе и инфекционной агалактии овец и коз во многом зависит от наличия профилактических в иммунобиологическом отношении вакцин и диагностических препаратов [4]. В основе изготовления данных препаратов используются производственные и контрольные штаммы микроорганизмов, получаемые биопредприятиями агропромышленного комплекса (АПК) из государственных коллекций микроорганизмов, где созданы оптимальные условия хранения, способствующие сохранности штаммов в жизнеспособном состоянии, а также их стабильности и всех присущих им генетических признаков (маркеров) [5, 6, 8]. Исходя из вышесказанного, целью работы явилось проверка жизнеспособности и биологических свойств штаммов А-319 и 8899 инфекционной агалактии овец и коз, находящихся в лиофилизированном состоянии при длительном хранении в герметически запаянных ампулах.

Материал и методы исследований . Для проведения исследований были взяты штаммы возбудителя инфекционной агалактии овец и коз, хранящиеся в лиофилизированном виде при температуре +4 – 8 ^оС в течение 20 лет:

• -    А-319 – аттенуированный, полученный путем многократного пассирования на развивающихся куриных эмбрионах, обладающий высокой иммуногенностью, не реактогенен, не реверсирует и не обладает контагиозностью;

• -    8899 – высоковирулентный, используется для контроля иммуногенной активности вакцин и для серологической диагностики инфекционной агалактии овец и коз.

Жизнеспособность штаммов определяли путем посева культур микроорганизмов пипеткой Пастера из ампул после суспендирования лиофилизата физиологическим раствором в пробирки на питательную среду Мартена с добавлением 20 % нормальной лошадиной сыворотки и 10 % дрожжевого экстракта рН 7,0-8,0. Помещали в термостат при 37 оС и культивировали в течение 6 суток, одновременно контролировали время появления первых колоний и характер их роста. Установив жизнеспособность штаммов и чистоту их посевов, делали две генерации для последующих исследований по определению культуральных свойств посевом культур на жидкую, полужидкую (добавление – 0,3 % агар агара) и твердую (2 % агар агара) питательные среды Эдварда с последующим инкубированием при 37 оС в течение 5 суток. Исследование тинкториаль-но-морфологических свойств проводили путем приготовления мазков из культур, их фиксации и окраски по Романовскому-Гимзе. Для этого подогретую до 90 оС краску вводили под предметное стекло, расположенное мазком вниз и окрашивали 20 минут. Изучение ферментативной активности осуществляли посевом культур на жидкую питательную среду с добавлением глюкозы, учет проводили через 10 дней инкубирования при 37 оС по изменению окраски среды. Для определения фосфатазной активности производили посев исследуемой культуры на плотную питательную среду в чашки Петри с добавлением фенолфталеиндифосфата (рН среды 7,8-8,0). Контроль результатов проводили в течение 14 дней: на 3, 7 и 14 сутки по одной испытуемой и контрольной чашке, вынимали из термостата, наносили на поверхность среды 5 N (нормальный) раствор едкого натра (200 г NаОН на 1 л дистиллированной воды). Полученные результаты сверяли с паспортными данными исследуемых штаммов.

Для проведения пассажа штаммов А-319 и 899 возбудителя агалактии овец и коз использовали развивающиеся 8-10 дневные эмбрионы кур (РЭК) по 3 эмбриона на штамм, которым вводили бульонную культуру в дозе 0,3 мл в аллантоисную полость закрытым способом и инкубировали в термостате при 37 оС. При гибели эмбрионов их вскрывали, делали посевы на жидкие и твердые питательные среды.

Результат исследований. Определение жизнеспособности штаммов А-319 и 8899 инфекционной агалактии овец и коз, хранящихся в лиофилизированном виде при температуре +4-8 оС в течение 20 лет, показало наличие на среде Мартена жизнеспособных микробов, что говорит о доста- точном проценте живых клеток в лиофилизированных культурах.

При изучении культуральноморфологических свойств наблюдали на твердых питательных средах (концентрация агар-агара 3 %) мелкие, прозрачные, росинчатые колонии, которые, разрастаясь в среде, выступают на поверхности в виде дисковидных возвышений с окруженной опаловой (более темной) зоной. На жидких питательных средах наблюдали рост в виде помутнения среды, который достигал максимума при 72-120-часовом инкубировании (оптимальный температурный режим 37-38 оС) и едва заметный придонный осадок, который при встряхивании поднимался со дна пробирки в виде волнообразного помутнения.

При окраске мазков, приготовленных из культур и окрашенных по Романовскому-Гимзе, в поле зрения отмечали мелкие полиморфные коккобактерии фиолетового цвета.

На жидкой питательной среде с добавлением глюкозы на 10 день инкубирования при 37 0С происходило изменение окраски среды, при постановке теста на фосфатазную активность регистрировали изменение цвета питательной среды с фенолфталеиндифосфатом после нанесения на ее поверхность 5 N (нормального) раствора едкого натра (NаОН), что говорит об их ферментативной и фосфатазной активности. Полученные данные соответствуют таксономическим показателям Myсoplasma agalactia [2].

Проведенные ранее нами исследования по определению жизнеспособности и биологических свойств штаммов Burkholderia mallei [6] и Mycobacterium bovis [7], хранившихся длительное время (13 и 20 лет соответственно) в лиофилизированном виде, показали также аналогичные результаты: штаммы не утратили способности роста и не изменили своих биологических свойств. Пассаж культур штаммов агалактии овец и коз через куриные эмбрионы показал, что все опытные эмбрионы погибли в течение 3-5 дней, при их вскрытии были отмечены патологоанатомические изменения в виде очаговых или точечных кровоизлияний и отеков на кож- ных покровах в области головы, шеи, спины, низа живота. Из посевов, сделанных с патологоанатомически измененных тканей эмбрионов на жидкие и твердые питательные среды, были выделены культуры возбудителя агалактии овец и коз. Исследование штаммов возбудителя агалактии овец и коз, хранящихся в течение 20 лет, в сравнении с предыдущими годами, показало, что в течение этого времени культуры остались стабильными, как по отношению основных биологических свойств, так и по количеству микробных клеток для получения их роста. Исследования будут продолжены до установления предельного (максимального) срока хранения.

Заключение. Работа в коллекции микроорганизмов направлена на создание оптимальных условий хранения штаммов возбудителей инфекционных болезней, где каждые 5 лет отслеживают сохранность жизнеспособности и основных биологических свойств лиофилизированных культур микроорганизмов, что позволяет вовремя принимать меры по устранению изменений в фенотипических характеристиках исследуемых штаммов. На основании проведенных исследований установлено, что штаммы А-319 и 8899 возбудителя инфекционной агалактии овец и коз, хранящиеся в лиофилизированном виде в течение 20 лет при температуре +4^о – 8^оС, сохранили свою жизнеспособность и биологические свойства, предусмотренные паспортными данными.

440-447.

Com. – 1987. – № 11. – Р. 191-198.

Резюме

В статье приведены данные о первых случаях выявления и распространения инфекционной агалактии овец и коз, как в России, так и за рубежом. Выявлено, что в основном это регионы с традиционным ведением овцеводства, к ним относятся регионы Европы, Азии, Африки, а также страны, расположенные по берегам Средиземного моря. Успех профилактики и ликвидации этого заболевания зависит от наличия профилактических вакцин и диагностических препаратов. Основой для их изготовления служат производственные и контрольные штаммы возбудителя, которые получают биопредприятия агропромышленного комплекса из государственных коллекций микроорганизмов. В коллекциях проводятся исследования штаммов с периодичностью, указанной в паспорте, а также создаются оптимальные условия, предотвращающие потерю микроорганизмами жизнеспособности и их биологических свойств при длительном хранении. В работе приведены результаты исследований штаммов А-319 и 8899 возбудителя инфекционной агалактии овец и коз, хранящихся в течение 20 лет в лиофилизированном виде. Полученные данные определения жизнеспособности и изучения биологических свойств штаммов, показали соответствие их паспортным данным.