История развития и передовые области применения ферментов (обзор)

Ферменты – это природные вещества, которые играют ключевую роль во многих промышленных процессах. Они не только экологически безопасны, но и обладают огромным потенциалом в различных сферах – от биотехнологий до производства потребительских товаров [1]. История использования ферментативных процессов восходит к древним временам, о чем свидетельствует практика получения спирта, известная еще в 7000 г. до н. э. Среди всего многообразия ферментов особый промышленный интерес вызывают целлюлолитические ферменты, к которым относятся эндоглюканазы, экзоглюканазы, β-глюкозидазы и ксиланазы. Эти соединения незаменимы в производстве биотоплива, пищевых продуктов, кормов для животных, текстиля, моющих средств, лекарств и бумаги [2, 3]. Другая важная группа – это лигнинпероксидазы, Mn-пероксидазы и лакказы. Они находят применение в текстильной промышленности, при обработке целлюлозы, в производстве кормов, моющих средств, продуктов питания, пива и косметики. Кроме того, эти ферменты эффективно удаляют разнообразные промышленные красители [4].

Грибы занимают особое место среди продуцентов промышленных ферментов благодаря высокой стабильности секретируемых веществ. Исторически ферменты использовали в хлебопечении, пивоварении, производстве сыра, антибиотиков, а также при обработке таких материалов, как лен и кожа. Сегодня более половины всех производимых ферментов получают именно из грибов, во многом благодаря их способности выделять ферменты во внешнюю среду [5].

В связи с этим цель настоящего исследования – комплексный анализ современных подходов к получению целлюлолитических и лигнинолитических ферментов с использованием промышленных отходов и оценка их потенциала. В обзоре последовательно рассмотрены исто- рические аспекты развития ферментативных технологий, характеристика промышленных отходов как альтернативных субстратов, биохимические основы разложения лигнина и целлюлозы, а также сравнительный анализ различных продуцентов, включая бактерии и грибы бу-рой/белой гнили. Особое внимание авторы уделяют вопросам оптимизации состава питательных сред, параметров культивирования и выбора нетрадиционных субстратов.

Материалы и методы

Поиск научных публикаций, релевантных к теме исследования, осуществляли в метапоисковой системе Google Scholar. Стратегия поиска включала использование таких ключевых слов, как «история развития применения ферментов», «валоризация лигноцеллюлозных отходов», «продуценты ферментов», «бактериальные ферменты», «ксилотрофные базидиомицеты», «глубинная ферментация», «области применения ферментов», «твердофазная ферментация», «целлюлазы», «ксиланазы», «β-глюкози-дазы». Поиск был сосредоточен как на классических работах, так и современных публикациях за период с 2021 по 2025 г. в рецензируемых журналах.

История развития и передовые области применения ферментов. Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы (за исключением каталитической РНК, которую также называют рибозимом). Термин «энзим» происходит от греческого слова, означающего «закваска» [6]. История изучения ферментативных процессов является важным разделом развития биотехнологии. В XIX в. терминологическое различие между понятиями «фермент» и «энзим» отражало различные точки зрения в теоретическом споре Л. Пастера, с одной стороны, и М. Бертло и К. Либиха – с другой, касающимся природы спиртового брожения. Знаковым достижением стало создание в 1823 г. И. Шутценбахом промышленного процесса уксуснокислого брожения, известного как «быстрое производство уксусной кислоты». Этимологически термин «фермент» (от лат. fermentum – закваска) первоначально применяли к живым организмам («организованные ферменты»), а термин «энзим» предложен был в 1876 г. В. Кюне для обозначения секретируемых клетками «неорганизованных ферментов», например, пепсина желудочного сока [7]. Э. Фишер в серии экспериментов 1894 г. обнаружил субстратную специфичность ферментов к гликозидам и олигосахаридам [8]. Переломным моментом стало описание Э. Бюхнером (1897) возможности спиртового брожения с использованием бесклеточного дрожжевого экстракта. Последовавшие за этими открытиями достижения в исследовании биохимических и молекулярно-биологических принципов привели к значительным прорывам в биотехнологии. Этот прогресс позволил расширить возможности технологического использования ферментов, в частности, в промышленности [9, 10] (табл. 1).

Разложение целлюлозы и лигнина. Разложение целлюлозы и гемицеллюлозы является ключевым процессом в биогеохимических циклах и имеет значительный потенциал для промышленного применения, включая производ- ство биотоплива и переработку отходов [11]. В природных экосистемах этот процесс осуществляется разнообразными микроорганизмами [12], включая как аэробные, так и анаэробные бактерии, а также грибы отдельных таксонов Ascomycota и Basidiomycota [13]. Последние подразделяются на грибы бурой гнили, белой гнили и мягкой гнили, в зависимости от их способности разлагать каждый тип лигноцеллюлозных компонентов.

Гидролиз целлюлозы происходит под действием гемицел-люлаз, которые разрывают гликозидную связь между двумя углеводами. Существует три типа гемицеллюлаз, различающихся по способу действия и месту расщепления [14, 15]:

• 1.    Эндоглюканазы расщепляют β-1,4-гликозидные связи во внутренней структуре и более активны в растворимой части субстрата. GH5–GH12, GH26, GH44, GH45, GH48, GH51, GH74 и GH124 считаются эндоглюканазами [16].

• 2.    Экзоглюканазы расщепляют связи на концах субстратов и высвобождают молекулы целлобиозы. К этой категории относятся GH3, GH43 и некоторые представители других семейств GH [17].

• 3.    β-глюкозидазы отвечают за расщепление целлобиозы, высвобождаемой эндоглюканазами и экзоглюканазами. β-глюкозидазы удаляют нередуцирующие концевые глюкозильные остатки из сахаридов и гликозидов, чтобы получить глюкозу [18]. GH1-GH3, GH5, GH30, GH39 и GH116 – ключевые β-глюкозидазы.

Из-за разнообразия состава гемицеллюлозы в ее расщеплении участвует множество ферментов. Для расщепления ксиланов эндоферменты ксиланазы, например, из группы GH10, гидролизуют β-D-ксилопиранозидные связи, высвобождая ксилобиозу, ксилоолигосахариды и ксилозу [там же]. В расщеплении маннанов участвуют β-маннана-за, β-маннозидаза, ацетилманнановая эстераза, β-глюко-зидаза и α-галактозидаза, относящиеся к GH1, GH2, GH3, GH5, GH26, GH27 и GH113 [19]. Основную цепь ксилоглюкана расщепляют представители GH74, GH29 и GH95, обладающие ксилоглюкан-специфичной эндо-β-1,4-глюканазной активностью [20].

Семейства карбоксилэстераз (CE) и вспомогательных ферментов (AA) способствуют действию GH в расщеплении целлюлозы и гемицеллюлозы. CEs воздействуют на пектиновые олигосахариды и арабиноксиланы, расщепляя сложно-эфирные связи и высвобождая ацил или алкил, в то время как семейства AA9–AA17 состоят из литических полисахаридных монооксигеназ (LPMO), которые расщепляют кристаллическую полисахаридную цепь целлюлозы и других углеводов посредством прямых окислительных реакций [21].

В целом бактерии и грибы используют схожие наборы ферментов, перечисленных выше, для расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы [22].

Эндоглюканазы некоторых видов грибов более эффективно воздействуют на аморфные домены. Скорее всего, это связано с тем, что у грибов больше эндоглю-каназ «удерживающего» типа, таких как GH7, GH5 и GH12 [23], чем у бактерий. Известно, что эндоглюканазы «удерживающего» типа нацелены на неупорядоченные домены целлюлозы, которые поэтому менее устойчивы [24].

Хронология ключевых открытий в ферментативных процессах

Chronology of key discoveries in enzymatic processes

Table 1

Год	Открытие	Ученые	Значение
1823	Разработан процесс ферментации уксусной кислоты	И. Шутценбах	Первый промышленный процесс с использованием ферментов
1833	Открытие диастазы (смесь амилаз)	А. Пайен	Первое выделение активного фермента
1836	Введение понятия «катализаторы» – химические вещества, ускоряющие реакцию без изменения своего состава	Й. Я. Берцелиус	Теоретическое обоснование катализа
1877	Введение термина «фермент»	В. Кюне	Разделение понятий «фермент» и «энзим»
1894	Модель «замок–ключ»	Э. Фишер	Объяснение субстратной специфичности ферментов
1897	Брожение без живых клеток	Э. Бюхнер	Доказательство работы ферментов in vitro , окончательное опровержение витализма
1913	Уравнение кинетики ферментов	Л. Михаэлис, М. Л. Ментен	Количественное описание ферментативных реакций
1926	Кристаллизация уреазы	Д. Б. Самнер	Доказательство белковой природы ферментов
1929	Установлены кофакторный механизм «зимаза/козимаза» (белковый фермент / небелковый кофермент) и механизм обратимой фосфатной активации спиртового брожения	А. Харден, Г. фон Эйлер-Хельпин	Начало изучения соединений промежуточного метаболизма
1934	Патент на биосинтез эфедрина		Первое промышленное применение иммобилизованных дрожжей (получение L-эфедрина)
1948	Теория стабилизации переходного состояния ферментами	Л. Полинг	Обоснование рационального дизайна лекарств, инженерии ферментов и промышленной биотехнологии
1949	Открыто и подробно классифицировано значительное количество классов ферментов		Систематизация ферментов
19401950	Синтез флавинадениндинуклеотида (ФАД) и аденозин-трифосфорной кислоты (АТФ), выявлены особенности их структуры и реакционных механизмов	А. Р. Тодд	Основа современных представлений о структуре и методах синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот
1950	Открытие возможности иммобилизации белков с сохранением об их функции		Первые шаги в биокатализе
1951	Определение аминокислотной последовательности (первичной структуры) инсулина	Ф. Сэнгер	Методологический прорыв в молекулярной биологии
1953	Модель структуры ДНК	Д. Уотсон, Ф. Крик	Фундаментальный прорыв, определивший дальнейшее развитие биологии
1958	Теория индуцированного соответствия	Д. Кошланд	Современное представление о механизме действия ферментов и их специфичности
19581960	Определены трехмерные структуры белка	Д. Кендрю, М. Перутц	Прорыв в структурной биологии
1965	Определена атомарная структура лизоцима с визуализацией активного центра	Д. Филлипс с соавт.	Доказательство теории индуцированного соответствия
1967	Кристаллическая структура химотрипсина выявила ключевые структурные элементы: классическая каталитическая триада и оксианионная полость		Создан структурный шаблон для предсказания функций неизученных гидролаз и конструирования искусственных ферментов
1971	Создан Банк данных белков (Protein Data Bank, PDB)		Систематизация структур белков
1978	Получение рекомбинантного инсулина		Начало эры генной инженерии в производстве ферментов
1982	Коммерческое производство человеческого инсулина		Появление биофармацевтики
1991	Зарождение современного биокатализа		Начало современной эры ферментативных технологий
20052007	Высокопроизводительные технологии секвенирования ДНК		Доступность полногеномного анализа
2010	Разработка трансаминазы для синтеза ситаглиптина		Первый пример рационального дизайна фермента для промышленного синтеза
2020	Биокаталитический каскад из девяти ферментов для производства ислатравира		Создание самой длинной полностью ферментативной цепочки для синтеза вещества

Разложение лигнина включает в себя деполимеризацию алкилароматических структур и последующее расщепление ароматического кольца. Деполимеризация осуществляется преимущественно посредством окислительной деструкции, а расщепление ароматического кольца – процесс переноса электронов на большие рас- стояния и окисление фенольных фрагментов [25]. Как у бактерий, так и у грибов расщепление ароматического кольца катализируется негемовыми железосодержащими интра- и экстрадиольными диоксигеназами [26]. Интра-диолдиоксигеназы расщепляют катехольные субстраты между гидроксильными группами с помощью негемового центра Fe (III), в то время как экстрадиолдиоксигеназы катализируют разрыв связи в положениях, смежных с гидроксильными группами, и обычно содержат негемовый центр Fe (II).

Способностью к разложению лигнина обладают как бактерии, так и грибы. Например, у гриба Aspergillus flavus скорость разложения лигнина составляет 44,6 % в течение 3 сут при оптимальных условиях [27], а у бактерии Bacillus cereus – 89 % [28].

Продуценты лигноцеллюлолитических ферментов. В контексте современного курса на устойчивое развитие лигноцеллюлолитические ферменты представляют собой перспективное решение для переработки значительных объемов лигноцеллюлозных отходов. Эти ферменты обеспечивают экологически безопасный и экономически целесообразный способ разложения биомассы, позволяя получать ценные продукты (биотопливо, химические вещества, корма и т. д.) и тем самым способствуя более устойчивой экономике.

Бактерии – продуценты лигноцеллюлолитических ферментов. Бактерии обладают огромным потенциалом в процессах биоконверсии лигноцеллюлозных субстратов. Большинство выделенных исследователями аэробных целлюлолитических бактерий относятся к отряду Actinomycetales (тип Actinobacteria) [29, 30], среди анаэробов преобладают представители отряда Clostridiales (тип Firmicutes) [31]. Термофильный аэроб Thermobifida fusca синтезирует комплекс лигнинолитических и целлюлолитических ферментов [32, 33], тогда как Clostridium thermocellum и Caldicellulosiruptor bescii расщепляют лигнин, используя высвобождающиеся сахара в качестве источника энергии [34]. Механизмы бактериальной деструкции актинобактериями и протеобактериями включают три основных процесса: деполимеризация лигнина, катаболизм ароматических соединений и биосинтез специфических метаболитов. В отличие от гидролитического расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы, деполимеризация включает окислительно-восстановительную реакцию, которая состоит из переноса электронов изменения редокс-потенциала [35]. Исследованные штаммы Sphin-gomonas, Pseudomonas, Rhodococcus и Nocardia демонстрируют различные стратегии расщепления лигнина для синтеза биопродуктов [36–41]. Zhang et al. [42] показали, углеводный и аминокислотный обмены были наиболее активными путями деградации лигноцеллюлозы, причем основную роль играли углеводно-активные ферменты (CAZymes) семейств CE1, CE4, AA3, AA7, CE3, AA4, GH3, GH1, GH2, AA1. Основными продуцентами этих ферментов выступают представители родов Pseudoxanthomonas, Pseudomonas, Saccharopolyspora и Microbispora.

В другой работе показано, что разложение лигноцеллюлозы у штаммов бактерий Pseudoxanthomonas, Ther-mopolyspora, Chelativorans, Thermobacillus сопряжено с циклом трикарбоновых кислот и пентозофосфатным путем [43]. Внимания заслуживают бактерии родов Bacillus и Clostridium , продуцирующие ферменты, которые эффективно функционируют в экстремальных условиях [44, 45]. Генетические исследования позволили идентифицировать лигнолитические ферменты у различных видов бактерий, однако следует отметить, что бактериальные стратегии расщепления менее изучены и считаются в целом менее эффективными по сравнению с грибами [46, 47]. Основными продуцентами лигнин-модифициру-ющих ферментов среди бактерий являются почвенные актиномицеты [48]. У бактерий обнаружены только два класса ферментов, расщепляющих лигнин: DyP-пероксидазы и Cu-содержащие оксидазы лигнина LMCO [49–51]. В табл. 2 приведены преимущества и недостатки бактерий как продуцентов ферментов [31].

Грибы – продуценты лигноцеллюлолитических ферментов. Грибы, разлагающие древесину, преимущественно представители класса Agaricomyces (Basidiomycota) и отдельных классов Ascomycota, играют ключевую роль в биодеградации лигноцеллюлозы [52]. Их классификация на грибы белой и бурой гнили основана на физиологических стратегиях.

Грибы бурой гнили , составляющие менее 10 % таксономического разнообразия базидиомицетов ( Coniopho-ra puteana, Fomitopsis pinicola, Gloeophyllum trabeum, Postia placenta, Serpula lacrymans и Wolfiporia cocos ) [53], используют неферментативный механизм разложения лигноцеллюлозы: вырабатывают гидроксильные радикалы, образующиеся в результате окислительно-восстановительной реакции между H₂O₂ и ионами Fe (III) в ходе реакции Фентона, окисляя кристаллическую целлюлозу и лигнин в древесине и создавая трещины в ее структуре [54]. По мере прорастания гифов в трещины, они выделяют гемицеллюлазу и эндоглюканазу для дальней-

Таблица 2

Table 2

Преимущества и недостатки бактерий-продуцентов ферментов

Advantages and disadvantages of enzyme-producing bacteria

Преимущества	Недостатки
Адаптивность: широкий диапазон устойчивости к температуре, pH	Чувствительность: подавление роста и активности под действием ингибиторов в лигноцеллюлозной биомассе
Универсальность: высокая пластичность метаболизма бактерий, толерантность к изменениям условий культивирования способствуют созданию более эффективных и рентабельных технологий биоконверсии	Эффективность: низкая скорость разложения лигноцеллюлозы для промышленных масштабов
Экологичность: бактериальная биоконверсия лигноцеллюлозы – экологичная альтернатива химическим методам переработки	Стоимость: высокие затраты на культивирование бактерий и оптимизацию процессов биоконверсии
Перспективность: возможности генной инженерии для улучшения штаммов	Масштабирование: технологические сложности поддержания стабильных параметров культивирования бактерий при переходе к промышленным объемам

шей деполимеризации гемицеллюлозы и целлюлозы [55], образуя кубическую структуру гнилей. Так, в работе Irbe et al. [56] показано, что необратимые процессы в клеточной стенке древесины начались сразу после колонизации древесины грибом Coniophora puteana . На начальной стадии разрушения клеточной стенки отмечено образование гидроксильных радикалов и выявлен достоверный рост УФ поглощения лигнина, свидетельствующий о его окислительной модификации. Результаты исследований подтверждают высокую способность F. pinicola разлагать лигнин мертвой древесины, коры [57, 58]. Химический анализ и ИК-Фурье-спектроскопия показали, что гриб бурой гнили G. trabeum преимущественно разрушал целлюлозу и гемицеллюлозу, в то время как гриб белой гнили T. versicolor разрушал как голоцеллюлозу, так и лигнин [59, 60].

Грибы белой гнили реализуют ферментативную стратегию. Первичная деструкция лигнина осуществляется внеклеточными ферментами, а именно оксидоредуктазами, лигнинпероксидазами, лакказами, Mn-пероксидазами, универсальными пероксидазами, Cu-радикалоксидазами, пероксидазами, деполимеризующими лигнин, что выражается в обесцвечивании, и фенолокисляющими многокомпонентными оксидазами, а также рядом медиаторов, например, активными формами кислорода, свободными радикалами и ароматическими промежуточными продуктами [61–63]. Грибы белой гнили – это сапротрофы, способные полностью разлагать лигнин с помощью лакказ и лигнин-модифицирующих пероксидаз, в результате чего в гниющей древесине остаются белые целлюлозные и гемицеллюлозные полимеры [64]. Последующий гидролиз полимеров осуществляется целлюлазой и гемицеллюла-зой. Представители этой группы являются основными редуцентами в лесах, и многие из них, такие как Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, P. eryngii и Flammulina velutipes , употребляют в пищу. Генетической особенностью грибов белой гнили является паралогичное расширение генов оксидаз и гидролаз (содержат несколько копий генов лакказы, пероксидазы, целлюлазного комплекса и глюкозидгидролаз). К числу наиболее изученных представителей относятся следующие виды: Auricularia delicata, Fomitiporia mediterranea, Ganoderma lucidum, Heterobasidion annosum, Perenniporia fraxinea, P. ostrea-tus, Punctularia strigosozonata, Schizophyllum commune, Stereum hirsutum и Trametes versicolor. Pleurotus ostrea-tus, P. pulmonarius и Lentinus sajor-caju обеспечивают снижение энергозатрат при рафинировании до 28 % за счет интенсивного расщепления лигнина при минимальных потерях глюкана. Trametes versicolor вызывал наибольшие потери глюкана [65]. Штамм Podospora anserina демонстрировал свою способность расщеплять лигнин за счет усиленного синтеза лакказ [66, 67].

Таким образом, как грибы бурой, так белой гнили способны разлагать лигнин, высвобождая ацильные и алкильные группы [51, 68–70], однако их механизмы деструкции принципиально различаются (табл. 3) [46, 71, 72]. Грибы бурой гнили реализуют преимущественно неферментативный путь, известный как реакция Фентона. Этот энергоэффективный процесс опосредован вза-

Таблица 3

Сравнительный анализ путей разложения лигнина

Table 3

Comparative analysis of lignin decomposition pathways

Критерий Грибы бурой гнили Грибы белой гнили Основной механизм Неферментный (реакция Фентона) Ферментативный (оксидоредуктазы) Первичная мишень Целлюлоза/ гемицеллюлоза Лигнин Энергоэффективность Высокая Умеренная Биотехнологический потенциал Ограничен Высокий имодействием ионов Fe (II) и пероксида водорода. В ходе реакции происходит восстановление Fe (III) до Fe (II) в растительных клетках с одновременным образованием гидроксильных радикалов -OH, которые деполимеризуют лигниновые полимеры [63, 72] и расщепляют целлюлозу и гемицеллюлозу, повышая их доступность для других гидролитических ферментов. Некоторые аскомицеты, включая возбудителей мягкой гнили, выделяют окислительные ферменты (лакказы и пероксидазы), которые катализируют окисление фенольных фрагментов лигнина и разрушают его структуру посредством пероксид-зави-симых реакций.

Факторы эффективного культивирования базидиоми-цетов: среды, условия и метаболические стратегии. Перспективность использования различных видов ксилотро-фных базидиомицетов для промышленного производства во многом определяется физико-химическими условиями и режимами их культивирования, оказывающими влияние на параметры роста мицелия и биомассу (максимальный сухой вес мицелия, максимальный рост мицелия, максимальная скорость роста мицелия, плотность мицелия, диаметр колонии и т. д.). Достижение максимального роста мицелия и высокой активности возможно при разнообразных условиях культивирования [73, 74].

Питательные среды условно классифицируются на натуральные, синтетические и полусинтетические. Синтетические среды (например, среда Чапека-Докса, декстрозный агар Сабуро) характеризуются стабильным составом, так как все компоненты известны и, как правило, содержат минимально необходимый набор веществ для роста: источники углерода, азота, реже – витамины, минеральные соли и аминокислоты. Натуральные среды состоят из органических веществ растительного или животного происхождения (растительные или древесные экстракты, пивное сусло, кокосовая вода и т. д.), а также побочные продукты (молочная сыворотка, сырная сыворотка, кровь и т. д.). Состав этих компонентов неизвестен полностью или имеет диапазон изменчивости для отдельных частей [75]. Полусинтетические среды включают синтетическую основу с добавлением незначительных количеств биологических компонентов: дрожжевого или грибного экстракта, гидролизата казеина, альбумина или нативной сыворотки крови. Например, агар с экстрактом солода (MEA).

В научных исследованиях для выращивания грибов преимущественно применяются синтетические и полусин-тетические среды, реже – среды на основе сельскохозяй- ственного сырья и отходов. Наиболее распространенным выбором являются различные коммерчески доступные обезвоженные питательные среды, такие как картофельный агар с декстрозой (PDA), MEA, агар Чапека-Докса (CDA), агар с экстрактом дрожжевого солода (YMEA), агар с кукурузной мукой (CMA), агар Сабуро с декстрозой (SDA), экстракт солодовых дрожжей (MYE) [76–82]. Стоит отметить, что традиционные синтетические и полусинтетиче-ские питательные среды не всегда обеспечивают более эффективный рост, чем натуральные [83]. Использование нетрадиционных субстратов, преимущественно производственных и сельскохозяйственных отходов, способствует значительному снижению себестоимости конечного продукта. К примеру, исследования показали положительное влияние состава среды на рост таких видов грибов, как Pleurotus cystidiosus и P. ostreatus [84], Cyclocybe cylindra-cea [78], Floccularia luteovirens [85], Lentinus swartzii [82].

Натуральные среды богаты биологически активными веществами, жизненно важными для роста грибов, и могут использоваться в качестве моносубстратов. Особенно востребованы природные среды на основе местных растительных и сельскохозяйственных отходов. Среди нетрадиционных субстратов для роста продуцентов ферментов ( Aspergillus niger, A. heteromorphus, A. fumiga-tus A. oryzae, Kuehneromyces mutabilis, Lentinus conatus, L. edodes, L. roseus, L. squarrosulus, L. subnudus, L. swart-zii, Macrolepiota deters, M. dolichaula, Pleurotus cystidiosus, P. djamor, P. eryngii, P. giganteus, Phaseolus aureus, P. os-treatus, P. sajor-caju, P. salmoneostramineus, Poria cocos, Pycnoporus cinnabarinus, P. sanguineus, Sarcodon aspratus, Schizophyllum commune, Stropharia rugosoannulata, Tram-etes versicolor, Tricholoma reesei, T. terreum, Volvariella volvacea ) используются пшеница, пшеничная солома и отруби, рис, желтая и белая кукуруза, кукурузные початки и солома, ячмень, овес, бобы, горох, фасоль, картофельная, банановая кожура, отходы кокосовой пальмы, трава, жом сахарного тростника, хлопковые отходы, жмых облепихи, яблони, семена льна, горчицы, рапса, рыжика, опил, кородревесные отходы и пр. [76–82, 86–88].

Однако рост грибов зависит не только от выбора питательных сред, но и от параметров культивирования: температуры, pH среды и аэрации. Не существует единой универсальной среды для оптимального роста всех видов грибов, поскольку диапазон температур для роста мицелия весьма широк. Температура является ключевым фактором, влияющим на метаболические процессы: ассимиляцию углерода и азота, дыхание и биосинтез [75]. Обычно исследователи сосредоточены на изучении таких основных температур роста, как минимальная (начало роста), оптимальная (наилучший рост) и максимальная (прекращение роста). Эксперименты проводят в диапазоне температур +10...+40° C с интервалом 5 или 10° C, редко 3º C [79, 83, 89–94]. Оптимальная температура существенно варьирует для разных видов и даже штаммов и может составлять от +10 до +45 °С.

Одним из важнейших химических факторов для выращивания грибов является pH среды, определяющим морфологические изменения и синтез метаболитов, рас- творимость солей и усвоение необходимых питательных веществ [95]. Известно, что грибы могут развиваться в широком диапазоне pH (от 2–3 до 10–12), наиболее часто исследования ведут в диапазоне pH от 4,0 до 9,0 [74, 83, 91, 93, 96–99]. Некоторые виды грибов проявляют ацидофильность (рН 0–5,5), нейтрофильность (5,5–8,0) или ал-калофильность (выше 8,0). Базидиомицеты представляют уникальную группу макромицетов, способных развиваться практически во всех наземных экосистемах, однако в целом слабокислая и нейтральная среды наиболее благоприятны для их роста.

Влияние источников углерода и азота на рост мицелия. Грибы как хемоорганотрофы получают энергию и углерод из органических соединений. Базидиомицеты, относясь к экологическим группам с различными трофическими стратегиями, используют разные источники углерода, такие как моносахариды, дисахариды, полисахариды, сахарные спирты, а также природные источники природного, такие как патока, черный сахар, ржаная мука. Эффективность использования моносахаридов можно схематически представить следующим образом: глюкоза > фруктоза > ксилоза = манноза > декстроза > галактоза > арабиноза.

Азот является одним из ключевых элементов, необходимых для роста грибов, поскольку не являются диа-зотрофами. Базидиомицеты используют широкий спектр органических (аминокислоты, пептиды, сложные органические соединения азота, белки) и неорганических (соли аммония, нитраты) источников азота. Ранжирование азотных субстратов по эффективности ассимиляции выявило следующую последовательность: аспарагин > аланин = глицин > аргинин > триптофан [75, 100–103].

Оптимальное соотношение C/N является критически важным параметром, регулирующим рост и метаболизм мицелия. Теоретически в питательных средах следует поддерживать соотношение C/N около 40/1. Однако анализ публикаций показал значительные отклонения от оптимального, в основном встречаются вариации от 1 : 1 [104, 105] до 20 : 1 [74, 106, 107].

Благодаря своим эффективным ферментативным системам грибы демонстрируют значительную селективность в отношении наиболее благоприятных источников углерода при относительно низкой селективности в отношении источников азота, что позволяет им адаптироваться к изменяющимся условиям культивирования.

Сферы промышленного применения ферментов. Ферменты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. В пищевой промышленности они используются при производстве сыра, пива, хлебобулочных изделий и других продуктов. В текстильной промышленности ферментативные процессы применяют для отбеливания, обработки и искусственного состаривания тканей. Фармацевтическая отрасль использует ферменты как для синтеза лекарственных препаратов, так и в диагностических системах. Особое значение ферменты имеют в производстве биотоплива, где осуществляют деполимеризацию лигноцеллюлозной биомассы до моносахаридов с последующей ферментацией в этанол (табл. 4).

Среди промышленно значимых ферментов особое место занимает целлюлаза, синтезируемая:

• •    грибами белой гнили: Agaricus arvensis, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia gigantean, Pleurotus ostreatus, Sporotrichum thermophile, Trametes versicolor;

• •    грибами мягкой гнили: Aspergillus niger, A. oryzae, A. nidulans, A. terreus, Chaetomium cellulyticum, C. thermophilum, Fusarium oxysporum, F. solani, Melanocar-pus albomyces, Humicola insolens, H. grisea, Mucor cir-cinelloides, Neurospora crassa, Paecilomyces inflatus, Penicillium brasilianum, P. decumbans, P. echinulatum, P. fumigosum, P. janthinellum, P. occitanis, Thermoascus aurantiacus, Trichoderma atroviride, T. harzianum, T. longibrachiatum, T. reesei;

• •    грибами бурой гнили: Coniophora puteana, Fomitopsis sp., Lanzites trabeum, Poria placenta, Tyromyces palustris;

• •    аскомицетами: Cellulomonas uda, C. fimi, C. bioazotea, Streptomyces drozdowiczii, S. lividans, Thermomono-spora curvata, T. fusca;

• •    анаэробными бактериями: Acetivibrio cellulolyticus, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium acetobutylium, C. cellulolyticum, C. papyrosolvens, C. thermocellum, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus;

• •    анаэробными бактериями: Acinetobacter amitratus, A. junii, Acidothermus cellulolyticus, Anoxybacillus sр., Bacillus amyloliquefaciens, B. circulans, B. flexus, B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis, Bacteriodes sp., Eubacterium cellulosolvens, Cellulomonas biazotea, Cellvibrio gilvus, Geobacillus sp., Microbispora bispora, Paenibacillus curdlanolyticus, Pseudomonas cellulosa, Rhodothermus marinu, Salinivibrio sp . [120–122].

Широкое промышленное применение целлюлаз: от их использования в составе моющих средств до сельскохозяйственных технологий, обуславливает актуальность производства этих ферментов из отходов (табл. 4). Важным преимуществом ферментативных процессов является их экологическая безопасность, поскольку они не приводят к образованию токсичных стоков в отличие от традиционных химических методов в процессах.

В производстве кормов гидролитическое воздействие целлюлаз и ксиланаз способствует выделению легкоусваиваемых моносахаридов для потребления молочнокислыми бактериями в пищеварительной системе жвачных животных, что оптимизирует ферментацию и повышает питательную ценность кормов.

Целлюлолитические ферменты играют ключевую роль в целлюлозно-бумажной промышленности, где их применяют в процессах биоотбеливания. Данная технология представляет собой экологически безопасную альтернативу традиционным химическим реагентам. Ферментативная обработка улучшает не только оптические свойства бумажной продукции, но и механические характеристики, такие как прочность на разрыв, индекс прочности, фактор разрыва, сопротивление двойному перегибу и воздухопроницаемость [123].

Накопление ферментов в процессе биоконверсии целлюлозы и лигнина. Ксилотрофные базидиомицеты являются эффективными продуцентами ферментов, разрушающих клеточную стенку растений [124]. Благодаря своим экологическим и биологическим особенностям они обладают высокой адаптивностью к разнообразным средам и ресурсам. Более того, некоторые виды демонстрируют исключительный потенциал в производстве определенных групп гидролитических ферментов при оптимальных условиях культивирования, что отражено в табл. 5.

В условиях глубинного культивирования Metreveli et al. [125] установили, что кристаллическая целлюлоза (МКЦ) является эффективным источником углерода для обеспечения максимальной активности эндоглюканазы, общей целлюлазы и ксиланазы у исследованных штаммов. Штамм Irpex lacteus характеризуется высокой продуктивностью (табл. 5), однако при его культивировании в ферментере необходимо создать условия, препятствующие накоплению редуцирующих сахаров в среде. Отмечен аддитивный эффект на секрецию целлюлазы и ксиланазы у I. lacteus при совместном использовании кристаллической целлюлозы и мандаринового жмыха, что может служить перспективным подходом для повышения выхода целевых ферментов. Исследования бразильских ученых показали, что культивирование штаммов грибов в консорциумах при твердофазной ферментации способствует более высокой выработке ферментов, расщепляющих лигноцеллюлозу, по сравнению с культивированием в монокультурах [126]. Анализ ферментативного потенциала штаммов Fomes fomentarius TMF2, Schizophyllum commune TMF3 и Bjerkandera adusta TMF1 F при культивировании на альтернативных субстратах (пивная дробина, подсолнечный,

Таблица 4

Некоторые области промышленного применения целлюлазных ферментов

Table 4

Some areas of industrial application of cellulase enzymes

Фермент	Отрасль производства	Применение	Ссылка
Целлюлазы	Синтетические моющие средства	Добавка в рецептуры	[108]
Ксиланазы	Текстильная	Состаривание ткани	[109]
		Полировка волокон	[110]
	Кормовая	Силосование	[111]
		Кормовая добавка	[112]
	Биотопливо	Получение редуцирющих сахаров	[110]
	Целлюлозно-бумажная	Деникинг макулатуры	[113]
	Переработка отходов	Ускорение компостирования	[114]
	Пищевая	Улучшение органолептических свойств теста	[115]
		Осветление соков	[116]
	Кормовая	Улучшение питательных свойств	[117]
	Целлюлозно-бумажная	Отбеливание целлюлозы	[118]
		Дейкинг макулатуры	[119]

Потенциал в производстве определенных групп гидролитических ферментов

Potential for the production of certain groups of hydrolytic enzymes

Table 5

Вид	Режим	Субстрат	Выход ферментов, ед./мл			Ссылка
			β-глюкозидаза	Ксиланаза	Целлюлаза
I. lacteus	ГК 27° C, рН 6,0 8 сут	Пшеничная солома	1,5	18	–	[125]
		В присутствии глюкозы/МКЦ: Жмых мандарина	0,87/0,82	23,8/24,5	11/14,2
		Пшеничная солома	1,34/2,08	39,1/63,2	29,4/46,5
		Пшеничные отруби	1,18/1,46	45,2/67,2	17,4/24,5
		Буковые опилки	0,21/0,38	10,3/8,2	3,8/4,3
A. fumigatus T. versicolor P. ostreatus	ТФФ	Жом сахарного тростника, пшеничные отруби	171,09	38	–	[126]
F. fomentarius	ТФФ 25° C, 190 об/мин 30 мин	Подсолнечный жмых	–	16,84	1,49	[128]
		Пивная дробина	–	15,88	1,42
		Соевый жмых	–	5,08	1,00
		Кофейный жмых	–	0,89	1,32
B. adusta		Подсолнечный жмых	–	12,88	3,71
		Пивная дробина	–	18,39	2,76
		Соевый жмых	–	5,06	0,44
		Кофейный жмых	–	1,21	0,95
S. commune		Подсолнечный жмых	–	13,21	2,51
		Пивная дробина	–	17,47	1,21
		Соевый жмых	–	1,86	0,68
		Кофейный жмых	–	6,23	0,78
S. commune ARC-11	ТФФ 30 °C, рН 7,0 8 суток	Рисовая солома	–	4288.3	–	[129]
P. sajor caju, P. ostreatus, P. chrysosporium	ТФФ (24 ± 2 °C, рН 7,0) 7 суток	Рисовые отруби	–	293	182	[130]
		Рисовая солома	–	81,9	34,3
		Пшеничная солома	–	124,3	97,8
		Сорговая солома	–	302,2	132,2
		Солома баджра	–	113,5	77,8
		Сорговое сено	–	84,7	95,5
		Кукурузная солома	–	118,4	113,3
Trametes hirsuta	ГК	Биомасса сорго	–	670 ед/л	540	[131]
Armillaria mellea NK-35	ТФФ, 26 °C 30 суток	Пивное сусло	–	13,5	31,2	[127]
	45 суток		–	27,8	48,4
P. ostreatus 0738	14 суток		–	11,4	19,3
	30 суток		–	7,1	11,4
Lentinus edodes F-249	14 суток		–	46	140
	45 суток		–	19	67,7
Ganoderma lucidum 0917	14 суток		–	27,5	13,3
	35 суток		–	8,0	8,0
Grifola frondosa 1315	14 суток		–	23,3	6,7
	35 суток		–	5,6	8,3
T. hirsuta F 3197	ТФФ 26 °С 30 суток	Кородревесные отходы				[132]
F. pinicola F 3205			–	–	1280
L. sulphureus F 3217			–	–	1051
			–	–	1109
F. pinicola F 3205	ГК 26 °С, 150 об/мин 16 суток	Кофейная шелуха	1170 ед./г	665	–	[133]
Rhodofomes roseus	ГК 26 °С, 150 об/мин 16 суток		1430 ед./г	5000	–

Условные обозначения. ГК – глубинное культивирование, ТФФ – твердофазная ферментация. Keys. ГК – submerged cultivation; ТФФ – solid-state fermentation.

соевый и кофейный жмыхи) подтвердил перспективность использования сельскохозяйственных отходов в качестве сырья для биосинтеза промышленно значимых ферментов. Оптимизация параметров культивирования позволила увеличить продукцию ксиланазы грибами белой гнили S. commune ARC-11 в 2,38 раза по сравнению с исходными условиями, при этом источником углерода служила рисовая солома. Высокие уровни ферментативной активности биомассы были также получены при культивировании штаммов Pleurotus sajor caju, P. ostreatus, Phanerochaete chrysosporium на различных сельскохозяйственных отходах. Потенциал в качестве лигноцеллюлозного субстрата для культивирования базидиоми-цета Trametes hirsuta AA-017 и производства ферментов (целлюлазы и ксиланазы) отмечен для биомассы индонезийских сортов сорго ( Sorghum bicolor L.). В исследовании Vetchinkina et al. [127] продемонстрировано влияние цветности грибных культур на активность ферментов.

Анализ состава кородревесных отходов склада в Республике Коми выявил высокое содержание питательных элементов, отсутствие токсичности и возможность использования для твердофазной ферментации ксилотроф-ных базидиомицетов ( Trametes hirsuta F 3197, Fomitopsis pinicola F 3205, Laetiporus sulphureus F 3217). Также штаммы Fomitopsis pinicola F 3205 и Rhodofomes roseus , культивируемые на кофейной шелухе, были эффективны в производстве β-глюкозидазы и ксиланазы (см. табл. 5).

Выводы

Настоящий обзор систематизирует развитие производства ферментов – от первых эмпирических разработок до современных методов направленного дизайна. Научные открытия складываются в единую картину, позволяя создавать новые, более совершенные промышленные процессы с использованием ферментов.

В статье подчеркивается важность лигниноцеллюли-тических ферментов грибов как устойчивой альтернативы химическому сырью. Кроме того, в исследовании особое внимание уделено текущему и потенциальному промышленному применению данных ферментов в таких отраслях, как производство биотоплива, сельскохозяйственных продуктов и восстановление окружающей среды. Эта работа дает первоначальное представление о более экологичных методах утилизации отходов и потенциальном использовании возобновляемых ресурсов.