Изготовление пастереллезного антигена

Диагноз на пастереллез ставят на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных, результатов бактериологического исследования и заражения лабораторных животных. Каждый из указанных методов диагностики не исключает друг друга и имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в особенности с результатами бактериологических исследований. Только анализ данных всех названных методов диагностики дает основание для правильной постановки диагноза на пастереллез (В.И. Геведзе, С.Г. Соколов, 1987).

Но все же традиционно применяемые методы диагностики по выделению Р. multocida из назальных смывов не всегда позволяют выявить субклинически больных бактерионосителей.

В связи с этим предпринимаются попытки разработки высокочувствительных методов серологической диагностики пастереллеза кроликов (N. M. Patton, 1988).

Цель исследования – изготовление пастереллезного антигена из культуры Р. multocida для ИФА.

Материал и методика . Для выполнения указанной цели провели наработку достаточного количества бактериальной массы, которая состоит из трех этапов:

• 1.    Освеженную путем 3-х кратного пассажа через организм белых мышей культуру Р. multocida внесли в пробирки с 10 мл МПБ с добавлением 6% глюкозы. Культивировали пастерелл в термостате при температуре 37⁰С, на вторые сутки рост пастерелл проявился в виде тонкой пленки на поверхности бульона и образованием слизистого осадка.

• 2.    После микроскопического контроля выросшей бульонной культуры путем окрашивания по Граму проводили пересев культуры по 10 мл в 0,5 литровые колбы, содержащие 490 мл мясопептонного бульона с добавлением 6% глюкозы. Выращивали посевы в течение пяти дней при температуре 37⁰С с последующим контролем характера роста и отсутствия контаминантов.

• 3.    В литровые колбы, содержащие по 860 мл мясопептонного бульона с 6% содержанием глюкозы, вносили по 140 мл выращенной в 0,5 литровых колбах бульонной культуры. Дальнейшее выращивание посевов продолжали 7-10 дней при температуре 37⁰С. Затем проводили контроль выращенной культуры по общепринятой в микробиологии методике.

После получения чистой пастереллезной культуры в литровых колбах, содержимое емкостей сливали в общий объем (в стерильную 5-ти литровую бутыль), тщательно встряхивали для получения однородной бактериальной взвеси и по 0,5 л разлили в 7 стерильных литровых колб.

С целью концентрации пастерелл путем осаждения в колбы внесли полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 (%) от общего объема:

1-1%; 2-3%; 3-5%; 4-7%; 5-9%; 6-11%; 7-13%. После добавления полиэтиленгликоля в указанных концентрациях колбы встряхивались на шуттель аппарате в течение 1 часа до полного растворения полиэтиленгликоля. В дальнейшем колбы поместили в холодильник на 72 часа при температуре +40 С для осаждения пастерелл.

Результаты исследований. В течение суток отстоя полного осаждения пастерелл при использовании полиэтиленгликоля в 1, 3 и 6% концентрациях от общего объема не происходило. Сбор осадка при этих концентрациях был затруднен, хотя его легко ресуспензировали. При 9, 11 и 13% концентрациях полиэтиленгликоля возникали затруднения с ресуспензированием осадка. 7% концентрация полиэтиленгликоля обеспечивала практически полное осаждение пастерелл из культуры в осадок в течение 24-48 часов. С колбы с 7% концентрацией надосадочную жидкость удаляли, а осадок представлял биомассу. Полученную биомассу проверяли на видовую специфичность (посев на питательные среды и микроскопия).

Концентрацию бактериальной массы проверяли по оптическому стандарту мутности для бактериальных суспензий и разводили до 10 млрд.

микробных тел в  1  мл 0,3% формалинизированным стерильным физиологическим раствором, который также и инактивирует пастерелл.

Заключение. В результате проведенных исследований была разработана рациональная схема получения пастереллезного антигена. Полученный пастереллезный антиген может быть использован для серологической диагностики пастереллеза у субклинически больных животных.

ЛИТЕРАТУРА:  1. В.И. Геведзе, С.Г. Соколов. Методические рекомендации по диагностике пастереллезов сельскохозяйственных животных. Минск. – 1987. – с.1-17. 2. Patton N.M. Pasterellosis in rabbits; A. review and update // J. appl Rabbit Res. – 1988. – 11/ - № 3. – P.III – 112. 3. Максуд Мунир. Усовершенствование методов постановки реакции диффузионной преципитации и встречного иммуноэлектрофореза для выявления антигенов и антител при пастереллезе. Автореф. дисс. канд. вет. наук. М., 1962. – с. 14.

ИЗГОТОВЛЕНИЕ ПАСТЕРЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА

Миннебаев Ш.Г., Юсупова Р.Х.

Резюме

В результате проведенных исследований была разработана рациональная схема получения пастереллезного антигена. Полученный пастереллезный антиген может быть использован для серологической диагностики пастереллеза у субклинически больных животных.

PASTEURELLA ANTIGEN MAKING

Minnebayev Sh.G., Yusupova R.H.