Изменчивость репродуктивных признаков у генотипов подсолнечника с различным содержанием жирных кислот и токоферолов в семенах

Acknowledgements. The research was conducted with the financial support of the Kuban Science Foundation as part of the scientific project № N-21.1/8.

Введение. Современная мировая тенденция в селекции подсолнечника как факультативно перекрестноопыляемого энтомофильного растения связана с необходимостью повышения завязываемости семян в условиях значительного снижения по техногенным причинам количества насекомых-опылителей. Для этого следует генетически повышать как автофертильность [1], так и аттрактивность цветущих растений к опылителям [2].

Сравнительная автофертильность сортов, инбредных линий и гибридов подсолнечника оценивается в 7, 37 и 43 % соответственно [3]. По другим данным, сорта показывают размах автофертильности 25–64 %, а гибриды – 53–97 % [4]. Несмотря на высокий процент автофертильности современных линий и гибридов, насекомые-опылители играют незаменимую роль на участках размножения материнских линий и участках гибридизации, где происходит перенос пыльцы от фертильного опылителя к материнской стерильной форме. Кроме того, при достаточном опылении насекомые не только повышают урожайность подсолнечника, но и улучшают качество семян [5; 6].

Нектар является материальной основой экологического мутуализма, при котором опылители, потребляя этот продукт, совершают перенос пыльцы и опыление [7]. Интенсивность посещения пчёлами корзинок подсолнечника напрямую зависит от нектаропродуктивности растений [8], которая определяется количеством нектара в трубчатых цветках. Этот признак обладает широкими пределами изменчивости. Количество нектара, выделяемое одним цветком подсолнечника, изменяется от 0,11 до 0,25 мг/цветок [9]. Пчёлы предпочитают собирать нектар с концентрацией сахара не менее 40–50 % [10]. Признак нектаропродуктивности подсолнечника характеризуется высокой наследуемостью и может быть улучшен путем селекции [11].

Важным селекционным признаком является мужская фертильность растений подсолнечника. Соцветие принято считать фертильным, если пыльники трубчатых цветков нормально развиты и в них находится пыльца [12]. Однако были по- лучены результаты, доказывающие, что растения подсолнечника могут иметь в развитых пыльниках до 50 % ненормальных, со значительными отклонениями по размерам пыльцевых зёрен [13]. Генотипы подсолнечника, имеющие морфологическую гетерогенность пыльцы, могут обладать низкой завязываемостью семянок. Поэтому в селекции подсолнечника необходимо проводить направленный отбор в сторону улучшения признака мужской фертильности.

С другой стороны, перспективным направлением в генетике и селекции подсолнечника является изучение признака высокоолеиновости и создание гибридов с данным типом масла, которое по жирнокислотному составу аналогично оливковому. Такое масло целесообразно использовать в пищевых целях для снижения крайне токсичных продуктов окисления липидов. Кроме того, для повышения окислительной стабильности масла используется также увеличение содержания в нем сильных антиоксидантов, например γ- и δ-токоферолов. Испанские учёные установили с использованием почти-изогенных гибридов подсолнечника негативное влияние мутации высокоолеино-вости Ol на автофертильность растений в некоторых генотипических средах [14].

В ходе наших предыдущих исследований обнаружен факт достоверного снижения значений ключевых репродуктивных признаков (количества и качества нектара, пчёлопосещаемости, завязывае-мости семян при свободном цветении, автофертильности, однородности и фертильности пыльцы) созданного впервые в мире во ВНИИМК высокоолеинового гибрида подсолнечника Окси с измененным составом токоферолов в масле семян (мутации tph1 и tph2 ) [15; 16; 17].

Для ответа на вопрос о возможной плейтропии вышеописанных мутаций на репродуктивные признаки следует провести исследование с использованием родительских линий гибрида Окси и линий генетической коллекции с различным со- четанием мутаций Ol, tph1 и tph2, включая почти-изогенные линии.

Целью данной работы было изучение комплекса репродуктивных признаков у генотипов подсолнечника с наследственно измененным составом жирных кислот и токоферолов в семенах для разработки генетических основ селекции на повышение завязываемости семян в условиях дефицита насекомых-опылителей.

Материалы и методы . Экспериментальные исследования проводили на опытных полях 1-го (2017 и 2020 гг.), а также 2-го (2022 г.) отделений ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар. Материалом для изучения был высокоолеиновый гибрид подсолнечника Окси с измененным составом токоферолов в масле семян, а также его материнская (ВК 876) и отцовская (ВК 195) родительские линии. Для получения семян F 1 гибрида Окси были выполнены скрещивания родительских линий в осенне-зимний период 2021–2022 гг. в условиях фитотронно-тепличного комплекса ВНИИИМК. Кроме того, в работе изучены селекционные линии и образцы генетической коллекции подсолнечника, различающиеся по содержанию олеиновой кислоты и составу токоферолов в семенах. В частности, использовали селекционные линии: ВК 905 Ol , ВК 934 Ol , ВК1-клп Ol , ВК 101 Ol , tph2 , ВК 678 tph1 и ВК 101. Образцы генетической коллекции представлены линиями: ЛД 102, КГ 49, Л 2138, Л 7247, И 7 246, К 1587, МВГ-8, К 2479, ВК 416, ЛГ 26, RIL 39, RIL 200 и I 5 Крупняк.

Растения подсолнечника выращивали в 2017 г. на однорядных, а в 2020 и 2022 гг. на четырёхрядных делянках при схеме посева 70 × 35 см по 25 растений в ряду.

Определение жирно-кислотного состава проводили в средних пробах семян на хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000». Общий состав токоферолов определяли методом тонкослойной хроматографии в средней пробе.

В работе изучено семь репродуктивных признаков: пчёлопосещаемость, ко- личество нектара, сахаристость нектара, диаметр пыльцевых зёрен, количество дефектных пыльцевых зёрен, завязывае-мость семянок и автофертильность.

Для определения пчёлопосещаемости использовали маршрутный метод. Учёт проводили на растениях второго-пятого дня цветения. Опыт выполняли в трёхкратной повторности. На четырёхрядных делянках учёт проводили на 50 корзинках двух центральных рядов, затем делали перерасчёт количества особей на корзинке в час:

Х2 = Х1 × 0,6, где Х1 – общее число пчёл на 50 растениях за 2 минуты;

Х 2 – особь/корзинка/час.

Пчёлопосещаемость на однорядных делянках изучали на 10 растениях, затем делали перерасчёт признака:

Х2 = Х1 × 12, где Х1 – общее число пчёл на 10 растениях за 30 секунд;

Х 2 – особь/корзинка/час.

Для оценки нектаропродуктивности за день до отбора нектара изолировали по пять корзинок каждого генотипа третьего дня цветения индивидуальными изоляторами для предотвращения сбора нектара насекомыми, которые могут посещать растения подсолнечника в ранние утренние часы.

На следующий день срезали подготовленные корзинки, ставили в ёмкость с водой и доставляли в лабораторию для дальнейшего исследования. Нектар отбирали с 40 трубчатых цветков в пыльниковой фазе каждой из пяти корзинок (200 цветков на генотип) одного дня цветения с помощью микрокапиллярных трубок с внутренним диаметром 0,25 мм и внешним – 0,50 мм.

После отбора нектара в микрокапил-лярную трубку его помещали на предварительно взвешенный диск фильтровальной бумаги и проводили повторное взвешивание. По разнице массы находили количество нектара. После высыхания диска, т.е. испарения водной части нектара, проводили повторное взвешивание. По разнице массы вычисляли долю сухого вещества (сахаристость) в нектаре.

Собранную пыльцу окрашивали ацето-орсеином в течение пяти минут, затем препарат микроскопировали с помощью цифрового микроскопа Биолаб TS-2000 LCD МС 20. Проводили измерение 200 пыльцевых зёрен и описывали морфологическую однородность пыльцы как показатель нормальной фертильности.

После созревания корзинки подсолнечника срезали и в лабораторных условиях индивидуально обмолачивали. Завязываемость семянок при свободном цветении и самоопылении (автофертильность) определяли как отношение выполненных семянок к общему числу семянок в корзинке (или количеству трубчатых цветков). Для подсчёта выполненных семянок использовали автоматический счётчик Automatic Seed Counter.

Результаты и обсуждение . Двухлетнее изучение пчёлопосещаемости 11 генотипов подсолнечника показало значительную наследственную изменчивость признака от 98 у К 2479 до 0,5 особи/корзинку/час у карликового И 7 246, т.е. почти в 200 раз (табл. 1). У гибрида Окси подтвердился низкий уровень пчёлопосещаемости – в среднем 14 особей/корзинку/час. Две другие вы-сокоолеиновые линии – ЛГ 26 и ВК 905 – также относились к этой низкозначимой категории. При этом ВК 905 обладает длинным венчиком трубчатых цветков, что, очевидно, может негативно влиять на доступность нектарников для опылителей.

Таблица 1

Пчёлопосещаемость растений подсолнечника (особь/корзинка/час)

ЦЭБ ВНИИМК, 1-е и 2-е отделение, г. Краснодар, 2017, 2022 гг.

Генотип	Год		Среднее за два года
	2017	2022
К 2479	160	36	98
МВГ-8	132	34	83
Л 2138	36	10	23
КГ 49	24	7	16
ВК 416	20	15	18
ЛД 102	20	15	18
ЛГ 26 Ol	12	8	10
Окси Ol, tph1, tph2	10	18	14
ВК 905 Ol	6	8	7
Л 7247	4	1	3
И 7 246	0	1	0,5
НСР 05	6	4	-

Две отобранные линии с максимальными значениями пчёлопосещаемости – МВГ-8 и К 2479 – ожидаемо имели за два года большее количество нектара (0,27 и 0,24 мг/цветок) и высокий уровень его сахаристости (55 и 47 % соответственно), чем три линии с минимальными значениями пчёлопосещаемости – И 7 246,     Л

7247 и Окси (табл. 2). При этом для изученных генотипов наблюдали положительную связь количества нектара и его сахаристости. Полученные данные подтверждают главную роль нектара трубчатых цветков в аттрактивности соцветия опылителям.

Таблица 2

Характеристика нектара трубчатых цветков у генотипов подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 1-е и 2-е отделение, г. Краснодар, 2020, 2022 гг.

Генотип	Количество нектара, мг/цветок			Сахаристость нектара, %
	2020 г.	2022 г.	среднее за два года	2020 г.	2022 г.	среднее за два года
МВГ-8	0,32	0,22	0,27	53	56	55
К 2479	0,25	0,23	0,24	40	53	47
И 7 246	0,22	0,09	0,16	46	45	46
Л 7247	0,15	0,12	0,14	40	24	32
Окси Ol, tph1, tph2	0,14	0,17	0,16	21	33	27
НСР 05	0,03	0,04	-	6	7	-

В 2022 г. 22 генотипа распределились по трём группам на основе содержания олеиновой кислоты в масле семян: высо- кое (80–90 %), среднее (50–63 %) и низкое (27–39 %) (рис. 1, табл. 3). Высоко-олеиновый фенотипический класс вызывается гомозиготным состоянием мутации Ol, за исключением низкоолеи-новой линии RIL 200, у которой мутация Ol находится под эпистатическим действием супрессора Sup и фенопически не проявляется (табл. 3).

Рисунок 1 – Содержание олеиновой кислоты в масле семян подсолнечника (ЦЭБ ВНИИМК, 2-е отделение, г. Краснодар, 2022 г.)

Пять генотипов коллекции обладали рецессивными мутациями tph1 и tph2 состава токоферолов в семенах (табл. 3, рис. 2). Для гибрида Окси, его родительских линий ВК 876 и ВК 195 характерно гомозиготное состояние по двум мутациям, приводящим к высокому содержанию γ- и δ-токоферолов. Мутация tph1 приводит к соразмерному накоплению α- и β-форм, а у мутации tph2 синтезируется преимущественно γ-форма. Дикий тип линии ВК 101 связан с присутствием в фенотипе только α-токоферола.

Таблица 3

Состав токоферолов в семенах у генотипов подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 2-е отделение, г. Краснодар, 2022 г.

Генотип	Состав токо		еролов, %
	α	β	γ	δ
Окси Ol, tph1, tph2	0	0	70,5	29,5
ВК 876 Ol, tph1, tph2	0	0	66,0	33,0
ВК 195 Ol, tph1, tph2	0	0	63,1	36,9
ВК 101 Ol, tph2	12,6	0	83,3	0
ВК 678 tph1	45,3	54,7	0	0
ВК 101	100	0	0	0
НСР 05	4,5	4,0	4,2	4,1

Рисунок 2 – Хроматограмма состава токоферолов в масле семян подсолнечника (ВНИИМК, г. Краснодар, 2022 г.):

1 – Окси Ol, tph1, tph2; 2 – ВК 876 Ol, tph1, tph2; 3 – ВК 195 Ol, tph1, tph2;

4 – ВК 101 Ol, tph2; 5 – ВК 678 tph1;

6 – ВК 101 дикий тип

Гибрид Окси обладал самым низким значением диаметра пыльцевых зёрен (29 мкм), одним из высоких значений доли дефектных пыльцевых зёрен (37 %), одним из низких значений автофертильности (19 %) и завязываемости семянок при свободном цветении (47 %) (табл. 4). При этом очевидна передача этих негативных признаков от материнской линии ВК 876 Ol, tph1, tph2 , а не от отцовской формы ВК 195 Ol, tph1, tph2 , которая характеризуется нормальными репродуктивными признаками при наличии всех 8

трёх мутаций высокоолеиновости и состава токоферолов в семенах.

Содержание олеиновой кислоты достоверно не коррелировало ни с одним из семи репродуктивных признаков (табл. 5). Однако установлены достоверные коэффициенты корреляции для шести пар репродуктивных признаков между собой: количество нектара – пчё-лопосещаемость (0,57), количество нектара – сахаристость нектара (0,55), количество нектара – количество дефектных пыльцевых зёрен (-0,55), количество дефектных пыльцевых зёрен – автофертильность (-0,72), количество дефектных пыльцевых зёрен – завязываемость (-0,47) и автофертильность – завязываемость (0,60).

Заключение. Изучен комплекс репродуктивных признаков у генотипов подсолнечника с наследственно измененным составом жирных кислот и токоферолов в семенах с целью обоснования селекции на повышение завязываемости семян при потенциальной нехватке насекомых-опылителей. Мутации качества масла семян подсолнечника: высокоолеиновости Ol и состава токоферолов tph1 и tph2 не обладали плейотропным действием на семь изученных репродуктивных признаков у образцов генетической коллекции. Этот факт позволяет прогнозировать эффективную селекционную работу по созданию продуктивных гибридов подсолнечника с улучшенным качеством масла.

Таблица 4

Характеристика репродуктивных признаков у генотипов подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 2-е отделение, г. Краснодар, 2022 г.

Генотип	Содержание олеиновой кислоты, %	Пчёлопосе-щаемость, особь/корзинка/час	Количество нектара, мкг/цве-ток	Сахаристость, %	Диаметр пыльцевых зёрен, мкм	Количество дефектных пыль-це-вых зёрен, %	Автофертильность, %	Завязывае-мость, %
Окси Ol, tph1, tph2	89,8	18	0,17	33	29	37	19	47
RIL 39 Ol	88,8	24	0,22	86	33	18	40	51
ВК1-клп Ol	88,4	12	0,13	39	32	14	61	74
ВК 934 Ol	88,1	10	0,25	68	32	10	40	58
ВК 905 Ol	88,0	8	0,19	73	33	6	50	64
ВК 876 Ol, tph1, tph2	87,0	8	0,05	27	31	30	24	40
ВК 101 Ol, tph2	86,9	9	0,20	37	31	15	42	62
ЛГ 26 Ol	85,4	8	0,12	51	32	16	33	70
ВК 195 Ol, tph1, tph2	79,6	7	0,14	59	32	6	56	63
МВГ-8	62,7	34	0,22	56	31	9	59	72
ВК 678 tph1	60,1	19	0,16	47	31	29	38	66
ВК 101	59,1	22	0,18	31	32	12	33	64
И 7 -246	57,6	1	0,09	45	31	17	18	61
Л2 138	51,1	10	0,19	15	32	26	5	44
К 1587	50,3	20	0,21	71	32	8	30	64
Л 7247	49,7	1	0,12	24	33	20	29	49
ВК 416	49,6	15	0,12	59	32	45	8	61
К 2479	38,9	36	0,23	53	33	9	36	64
RIL 200 Ol Sup	31,0	13	0,15	66	31	11	46	52
КГ 49	30,6	7	0,10	36	30	45	13	48
I 5 Крупняк	29,2	14	0,07	-	31	24	38	68
ЛД 102	26,9	15	0,19	64	33	14	31	58
НСР 05		4	0,04	7	1	4	8	9

Таблица 5

Корреляция содержания олеиновой кислоты в масле семян с репродуктивными признаками подсолнечника (n=22)

ЦЭБ ВНИИМК, 2-е отделение, г. Краснодар, 2022 г.

Показатель	1	2	3	4	5	6	7
Содержание олеиновой кислоты (1)
Пчёлопосещаемость (2)	-0,14
Количество нектара (3)	0,15	0,57*
Сахаристость нектара (4)	0,05	0,30	0,55*
Диаметр пыльцевых зёрен (5)	-0,03	0,09	0,35	0,40
Количество дефектных ПЗ (6)	-0,17	-0,18	-0,50*	-0,41	0,18
Автофертильность (7)	0,32	0,25	0,29	0,34	0,23	-0,72*
Завязываемость (8)	0,05	0,31	0,17	0,18	0,20	-0,47*	0,60*

* – достоверно на 5%-ном уровне значимости