Изменение адренореактивности эритроцитов под действием милдроната

Установлено, что УПР протекает на фоне нарушения адренергического механизма [2, 3, 5, 7]. С момента открытия эндогенного сенсибилизатора β-адренорецепторов (ЭСБАР) [1, 2, 4–6] выдвигалось предположение о возможности клинического применения его аналогов для лечения состояний, связанных с низкой эффективностью данного механизма. Таким аналогом является блокатор окисления жирных кислот – милдронат, или 3-(2,2,2-три-метилгидрозиний) пропионата дигидротат. В экспериментах с гладкомышечными объектами в 2002 г. было показано, что милдронат повышает способность адреналина оказывать релаксирующий эффект, реализуемый за счет активации β2-АР [6]. Направленность сенсибилизирующего действия подтверждается наличием данного эффекта в случаях с гладкими мышцами тех органов, где представлены β2-АР (трахея, миометрий, коронарные артерии) и отсутствием эффекта – в опытах с миокардом β1-АР. С учетом данных о наличии в организме человека и животных ЭСБАР прямого действия, наиболее вероятными компонентами которого являются гистидин, триптофан и тирозин, полученные результаты исследования (по аналогии) позволили рассматривать милдронат как экзогенный β-адреносенсибилизатор прямого действия. Основу β-сенсибилизирующего эффекта милдро-ната, вероятнее всего, составляет его способность повышать эффективность взаимодействия адреналина (и норадреналина) с β-АР. С учетом современных представлений о физиологии β-АР можно предположить, что эта способность реализуется за счет одного из трех возможных процессов: 1) аллостерического изменения конформационного состояния β-АР, в результате которого возрастает сродство рецептора к агонисту; 2) ингибирования активности ряда ферментов, участвующих в фосфорилировании β-АР (киназы β-АР, протеинкиназы α- и β-аррестина), благодаря которому рецепторы утрачивают сродство к агонисту; 3) за счет повышения активности фосфатазы, участвующей в дефосфорилировании β-АР и тем самым восстанавливающей их сродство к агонисту.

На основании вышеизложенного мы предположили, что использование милдроната (экзогенного β-адреносенсибилизатора) позволит усилить действие β-адреномиметиков и тем самым снизить дозу используемого препарата и в конечном результате уменьшить количество побочных эффектов.

Целью нашей работы явилось изучение β2-сенсибилизирующего действия милдроната in vitro методом адренозависимой осморезистентности эритроцитов (А-ОРЭ) у небеременных женщин и беременных при физиологически протекающей беременности и при УПР.

Материалы и методы исследования. В данном исследовании использовали венозную кровь 53 небеременных и беременных женщин с физиологическим течением беременности и с признаками УПР.

Первую группу составили образцы крови 13 небеременных женщин репродуктивного возраста (средний возраст – 29,6 ± 6,3). Вторую группу составили образцы крови 20 беременных женщин на сроке беременности 24–36 недель без признаков угрозы прерывания. Средний возраст женщин этой группы составил 26,2 ± 3,5 года. Комплексные критерии включения женщин во 2-ю группу – отсутствие острых или обострения хронических воспалительных заболеваний генитальной и экстрагени-тальной сферы, отсутствие признаков угрозы прерывания беременности (по отсутствию жалоб, по состоянию родовых путей, по данным наружной гистерографии, колостроцитограммы). В 3-ю группу были включены образцы венозной крови 20 беременных женщин на сроке беременности 24–36 недель с признаков угрозы прерывания беременности. Средний возраст – 25,5 ± 3,4 лет. Комплексные критерии включения женщин в эту группу: наличие признаков угрозы прерывания беременности (жалобы, состояния родовых путей, данные наружной гистерографии, колостроцитограммы), отсутствие острых или обострение хронических воспалительных заболеваний генитальной и экст-рагенитальной сферы.

Методика определение А-ОРЭ. Кровь в объеме 8 мл получали из локтевой вены с 8–10 ч утра; к ней добавляли 2 мл антикоагулянта (5 % раствор цитрата натрия). ОРЭ оценивали по методу Идель-сона Л.И., используя в качестве гипотонического раствора 0,42 % раствор NaCl. Кровь в объеме 0,1 мл добавляли в 2 пробирки с холостыми пробами (одна с 5 мл дистиллированной водой, вторая – с 5 мл 0,9 % раствором NaCl), а также в контрольную пробирку и 4 ряда опытных пробирок (по 6 в каждую). В пробирки с холостыми пробами и в контрольную пробирку добавляли 0,02 мл 0,9 % раствора NaCl. В 1–4-й ряды опытных пробирок добавляли по 0,02 мл адреналина (1-й и 3-й ряды) и гинипрала (2-й и 4-й ряды) в возрастающей концентрации соответственно 10–10 10–9 10–8 10–7 10–6 10–5, а в 3-й и 4-й ряды добавляли 0,02 милдроната в концентрации 10–5 г/мл. Затем все пробирки инкубировали в термостате типа ТС-80М-2 в течение 10 мин при температуре 37 °С, после чего во все пробирки (кроме холостых проб) добавляли по 5 мл 0,40 % раствора NaCl и повторно инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С, подвергая в дальнейшем 5-минутному центрифугированию на центрифуге типа ОПн-8УХЛ4 при 2000 об/мин. Для каждой пробирки измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости (против надосадочной жидкости, содержавшейся в холостой пробе с 1 % раствором NaCl) на фотоэлектроколориметре типа КФК-2 с зеленым светофильтром при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Величина оптической плотности надосадочной жидкости опытной пробы выражали в процентах к оптической плотности надосадочной жидкости пробы с дистиллированной водой.

Результаты исследования Небеременные

В образцах крови небеременных женщин имеются достоверные отличия в абсолютных значениях ОРЭ между различными концентрациями адреналина и ганипрала, причём в среде ганипра-ла эти значения меньше значений ОРЭ в среде с адреналином различной концентрации. Так, при концентрации адреналина 10–5 г/мл ОРЭ составляет 315,4 ± 33,00, при концентрации гинипрала 10–5 г/мл – 275,5 ± 35,2. Достоверные отличия во всех концентрациях. Дозозависимости нет в обоих случаях (табл. 1).

Милдронат в концентрации 10–5 г/мл, добавленный к среде адреналина разной концентрации, практически никак не влияет на значения ОРЭ. Достоверные отличия только в среде адреналина 10–7 г/мл: так при концентрации адреналина 10–5 г/мл ОРЭ составила 315,4 ± 33,00, при добавлении в эту среду милдроната 10–5 г/мл абсолютное значение ОРЭ составило 318,1 ± 25,5. В % от Е0 в этой же концентрации адреномиметика значение ОРЭ составило 32,43 ± 2,3, при добавлении в эту среду милд-роната в концентрации 10–5 г/мл значение в % от Е0 составило 32,70 ± 2,5. Отличия недостоверны во всех концентрациях адреномиметика, кроме 10–7 г/мл.

Таблица 1

Осморезистентность эритроцитов (абсолютные значения и в % от Е0) (M ± m)

Концентрация, г/мл	Е0	Ек	10–5	10–6	10–7	10–8	10–9	10 –10
Адреналин	972,6 ± 35,3	323,5 ± 33,6	315,4* ± 33,0	323,2* ± 30,6	310,3*¹ ± 33,42	313,5* ± 34,32	314,6* ± 31,9	302,1* ± 33,13
В % к Е0			32,43** ± 2,3	33,23** ± 2,82	31,9**² ± 2,6	32,23** ± 3,0	32,35** ± 2,93	31,06** ± 2,5
Адреналин + милдронат 10–5 г/мл			318,1 ± 25,5	350,3 ± 24,2	348,12 ± 26,5	315,3 ± 25,2	319,4 ± 23,5	310,5 ± 22,1
В % к Е0			32,70 ± 2,5	35,6 ± 2,2	35,8 ± 2,1	32,4 ± 2,5	32,8 ± 1,8	31,57 ± 2,1
Гинипрал			275,5³ ± 35,2	268,2³ ± 32,3	270,3³ ± 32,5	280,22³ ± 33,6	277,6³ ± 34,3	276,4 ± 31,2
В % к Е0			28,33 ± 2,2	27,6 ± 3,1	27,8 ± 3,2	28,8 ± 3,8	28,54 ± 2,8	28,4 ± 2,85
Гинипрал + милдронат 10–5 г/мл			356,2 ± 35,2	322,3 ± 35,8	379,4 ± 33,3	367,3 ± 34,2	389,6 ± 35,1	355,12 ± 35,8
В % к Е0			36,60 ± 3,2	33,11 ± 3,1	38,97 ± 2,7	37,73 ± 3,5	40,00 ± 2,8	36,50 ± 3,6

Примечание. * – достоверные отличия показателей абсолютных показателей ОРЭ в среде адреналина и ги-нипрала (р < 0,05); ** – достоверные отличия показателей ОРЭ в % к Е0 в среде адреналина и гинипрала (р < 0,05); ¹ – достоверные отличия показателей абсолютных показателей ОРЭ в среде адреналин и адреналин + милдронат 10–5 г/мл (р < 0,05); ² – достоверные отличия показателей ОРЭ в % к Е0 в среде адреналина и адреналин + милдронат 10–5 г/мл (р < 0,05); ³ – достоверные отличия показателей абсолютных показателей ОРЭ в среде гинипрал и гинипрал + милдронат 10–5 г/мл (р < 0,05); º – достоверные отличия показателей ОРЭ в % к Е0 в среде гинипрал и гинипрал + милдронат 10–5 г/мл (р < 0,05). То же в табл. 2, 3.

Николаева И.С., Медведев Б.И., Помаскин И.Н.

Напротив, в среде гинипрала милдронат в концентрации 10–5 г/мл повышает как абсолютные значения ОРЭ, так и в % от Е0. Так при концентрации гинипрала 10–5 г/мл ОРЭ составила 275,5 ± 35,2, при добавлении в эту среду милдроната 10–5 г/мл абсолютное значение ОРЭ составило 356,2 ± 35,2, в % от Е0 без милдроната значение составило 28,33 ± 2,2, а при добавлении милдроната 10–5 г/мл – 36,6 ± 3,2.

Таким образом, милдронат у небеременных усиливает действие гинипрала – селективного β2-адреномиметика, а на действие адреналина влияния не оказывает.

Беременные с физиологическим течением

Милдронат 10–5 г/мл как в среде с адреналином, так и в среде с гинипралом достоверно уси-

Изменение адренореактивности эритроцитов под действием милдроната ливал их действие. В среде с адреналином10–6 г/мл (без милдроната ) % к Е0 составил 68,5 ± 3,6, при добавлении милдроната 10–5 г/мл % к Е0 составил 80,86 ± 3,2. Милдронат сильнее усиливает действие гинипрала. Так в среде с гинипралом 10–6 г/мл (без милдроната ) % к Е0 составил 63,2 ± 3,2, при добавлении милдроната 10–5 г/мл % к Е0 составил 94,2 ± 3,28 (табл. 2).

Беременные с УПР

В группе с УПР абсолютные значения в среде адреналина и гинипрала достоверно отличимы при всех концентрациях адреномиметиков, кроме крайних – 10–5 и 10–10 г/мл (табл. 3).

В % к Е0 в среде адреналина и гинипрала достоверные отличия показателей ОРЭ только в концентрации 10–6, 10–7, 10–8 г/мл. Милдронат усиливает действие и адреналина и гинипрала – отличия

Таблица 2

Осморезистентность эритроцитов (абсолютные значения и в % от Е0) (M± m)

Концентрация, г/мл	Е0	Ек	10–5	10–6	10–7	10–8	10–9	10 –10
Адреналин	920,3 ± 22,2	489,5 ± 24,22	633,5*¹ ± 23,3	630,5*¹ ± 25,3	638,2*¹ ± 24,3	640,00*¹ ± 24,4	623,3*¹ ± 24,3	625,4*¹ ± 24,8
В % к Е0			68,8**² ± 3,3	68,5**² ± 3,6	69,3**² ± 3,08	69,54**² ± 3,7	67,73**² ± 3,0	68,0**² ± 3,2
Адреналин + милдронат 10–5 г/мл			734,32 ± 25,5	740,2 ± 25,3	722,3 ± 23,3	712,5 ± 26,4	689,4 ± 22,2	700,2 ± 22,3
В % к Е0			79,7 ± 3,2	80,86 ± 3,2	78,37 ± 3,08	77,37 ± 3,8	74,8 ± 3,2	76,3 ± 3,5
Гинипрал			592,2³ ± 22,2	586,3³ ± 22,9	575,2³ ± 24,2	598,20³ ± 23,2	569,2³ ± 23,2	567,00³ ± 24,2
В% к Е0			64,35 º ± 3,2	63,2 º ± 3,2	62,6 º ± 3,6	65,00 º ± 3,27	60,85 º ± 3,56	61,60 º ± 3,7
Гинипрал + милдронат 10–5 г/мл			844,3 ± 24,1	867,3 ± 24,3	880,1 ± 22,7	845,3 ± 25,3	850,5 ± 22,5	860,0 ± 26,2
В % к Е0			91,74 ± 3,2	94,2 ± 3,28	95,63 ± 3,2	91,85 ± 3,2	92,42 ± 3,2	93,45 ± 3,2

Таблица 3

Осморезистентность эритроцитов (абсолютные значения и в % от Е0) (M ± m)

Концентрация, г/мл Е0 Ек 10–5 10–6 10–7 10–8 10–9 10–10 Адреналин 900,6 ± 35,01 548,2 ± 34,2 510,5¹ ± 33,5 498,8*¹ ± 33,6 478,4*¹ ± 33,6 482,4*¹ ± 32,3 493,4*¹ ± 33,5 472,3¹ ± 32,2 В % к Е0 56,68² ± 3,6 55,34**² ± 3,3 53,1**² ± 3,10 53,56**² ± 3,41 54,8² ± 3,26 52,45² ± 3,4 Адреналин + милдронат 10–5 г/мл 708 ± 25,3 757 ± 25,2 760 ± 23,3 735 ± 28,2 700 ± 26,32 700 ± 27,2 В % к Е0 78,61 ± 3,12 84,06 ± 3,4 84,39 ± 3,3 81,61 ± 3,8 77,73 ± 3,7 77,73 ± 3,1 Гинипрал 515,00³ ± 34,3 534,4³ ± 34,3 534,5³ ± 31,2 522,7³ ± 33,4 505,9³ ± 31,2 499,5³ ± 32,8 В % к Е0 57,18 º ± 2,9 59,34 º ± 2,4 59,35 º ± 2,3 58,04 º ± 2,4 56,18 º ± 3,6 55,46 º ± 2,7 Гинипрал + милдронат 10–5 г/мл 818 ± 36,3 825 ± 35,3 823 ± 36,1 840 ± 32,3 722 ± 38,5 730 ± 31,5 В% к Е0 90,83 ± 4,9 91,61 ± 3,93 91,38 ± 4,3 93,27 ± 4,6 80,17 ± 3,92 81,06 ± 4,32 статистически достоверны во всех концентрациях. Но так же как и в группе беременных с физиологическим течением беременности, милдронат достоверно сильнее усиливает действие гинипрала.

Полученные данные доказывают свойство милдроната усиливать действие в-адреномиме-тиков, в частности реализуемых за счет активации в2-АР. Так как действие милдроната в группах беременных с физиологическим течением и с признаками УПР - однонаправленное (усиливает действие как адреналина, так и гинипрала, причём второго значительнее), всё вышеизложенное подтверждает гипотезу о том, что УПР протекает на фоне нормальной в-адренореактивности.