Изменение биологических свойств бактерий Staphylococcus epidermidis 33 при формировании устойчивости к ванкомицину

Использование гликопептидного антибиотика ванкомицина (Van) для лечения заболеваний, вызванных грамположительными микроорганизмами, введено в практику в 1958 г. и, несмотря на появление резистентных к этому антибиотику штаммов Staphylococcus epidermidis [21], а затем устойчивых к Van энтерококков [17] и золотистых стафилококков [12], он продолжает оставаться препаратом выбора для лечения инфекций, обусловленных мети-циллинрезистентными S. aureus [13], метициллин-резистентными коагулазонегативными стафилококками (КНС) [22], а также энтерококками, устойчивыми к бета-лактамным антибиотикам и аминогликозидам [1, 14].

Устойчивые к Van бактерии обладают выраженными биологическими особенностями. В частности, для штаммов S. aureus со сниженной чувствительностью к этому гликопептиду характерно существенное утолщение клеточной стенки и формирование новых мишеней действия, локализованных вдали от истинных мишеней антибиотика на плазматической мембране [9, 11]. Обнаружена также реципиентность этими штаммами детерминант резистентности к гликопептидам от энтерококков, обуславливающая возрастание уровня устойчивости стафилококков к Van до характерного для энтерококков [6, 7]. Вместе с тем, механизмы формирования устойчивости КНС к гликопептидам практически не изучены [8]. Показано лишь, что резистентные к Van КНС отличаются по некоторым свойствам от чувствительных бактерий, в частности, изменению клеточной стенки, появлению множественной устойчивости к антибактериальным препаратам, характеру сорбции антибиотика из среды культивирования. Обнаружено также, что природа устойчивости КНС к Van является гетерогенной [8], что характерно и для другого вида стафилококков – S. aureus . Для некоторых изолятов КНС, как и для S. aureus , выявлена способность к образованию биопленок в присутствии гликопептидов [10].

Несмотря на то, что штаммы КНС менее патогенны, чем штаммы S. aureus , они часто являются источником ассоциированной инфекции, а также заражения медицинских имплантатов [18]. Представленное отражает необходимость дополнительных исследований природы устойчивости КНС к Van и поиска путей ее преодоления.

В связи с этим в настоящей работе исследованы изменения физиологических характеристик коллекционного штамма S. epidermidis 33 при культивировании его на средах с возрастающими концентрациями Van с получением устойчивого к этому антибиотику варианта – S.epidermidis 33 Van^r, с оценкой чувствительности мутантного штамма к низкомолекулярному катионному пептиду варне-рину.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Выращивание бактерий проводили в питательной среде LB [4] на орбитальном шейкере Certomat (“Sartorius”, Германия) при 150 об/мин и температуре 370C. За динамикой роста следили по изменению оптической плотности бактериальных культур при 600 нм на спектрофотометре PD-303 (“APEL”, Япония).

Получение ванкомицинустойчивого штамма S. epidermidis 33 Van^r проведено последовательными пересевами исходного чувствительного к Van штамма S. pidermidis 33 на среду LB c повышающимися концентрациями Van. Селекцию начинали с концентрации Van в жидкой среде, близкой минимальной подавляющей концентрации (МПК) Van для данного штамма. Клеточные суспензии затем высевали на чашки с LB-агаром с той же концентрацией Van. После появления колоний их инокулировали в жидкую среду с повышенной концентрацией Van и культивировали до видимого роста. Таким образом, через 16 пассажей на жидкой среде бактерии были способны к росту в присутствии 32 мкг/мл Van.

МПК Van изучаемых штаммов определяли методом двукратных серийных разведений в 96-луночных иммунологических планшетах. В лунки, содержащие питательную среду LB, вносили бак- терии логарифмической фазы роста в конечной концентрации 105 колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл). Определение чувствительности бактерий к низкомолекулярному пептиду варнерину проводили, как представлено ранее [3, 16]. Чувствительность к антибиотикам выявляли методом диффузии с дисков [5].

Степень сохранности устойчивости резистентного штамма к Van оценивали после 20 последовательных пассажей на питательной среде LB без антибиотика методом двукратных серийных разведений в иммунологических планшетах. Степень гидрофобности поверхности бактериальных клеток определи с помощью BATH-теста в двухфазной системе с гексадеканом [20].

Экстракцию и идентификацию липидов проводили по методу Блайя и Дайера [2]. Для тонкослойной хроматографии использовали пластинки Sorbfil (Россия) (сорбент – силикагель, толщина слоя 110 мкм). Разделение смеси липидов проводили в системе: хлороформ-метанол-вода (65:25:4, v/v). После разделения липидов пластинки окрашивали 10% фосфорномолибденовой кислотой в этаноле для определения общего состава липидов, 1% нингидрином в ацетоне – липидов, содержащих свободные аминогруппы, реактивом Цинцаде – фосфолипидов, α-нафтолом – гликолипидов [2].

Аутолиз исследуемых штаммов проводили в 10 mM трис HCl-буфере, pH 7.2 при 370C в течение 4 ч с перемешиванием при 150 об/мин на шейкере Cer-tomat (“Sartorius”, Германия). Для этого бактериальные культуры выращивали на среде LB до середины логарифмической фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием (13200 об/мин, 10 мин) на центрифуге 3К30 (“Sigma”, Германия), дважды отмывали в том же режиме исходным указанным выше буфере и ресуспендировали в нем до плотности ~1.0 при 600 нм. Для активации аутолитических процессов к препаратам бактерий добавляли низкомолекулярный пептид варнерин в концентрации 1 мг/мл. Степень лизиса определяли по изменению оптической плотности клеточных суспензий при 600 нм и по количеству живых клеток постановкой теста на КОЕ, отбирая пробы ежечасно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружено, что селекционированный в лаборатории Vanr-штамм обладал высоким уровнем устойчивости к ванкомицину (МПК ≥400 мкг/мл). Формирование Vanr-фенотипа производного штамма сопровождалось снижением интенсивности роста по сравнению с чувствительным штаммом. Сравнение динамики роста изученных штаммов представлено на рис. 1.

Рис. 1. Динамика роста (А) S.epidermidis 33 и (Б) S.epidermidis 33 Van^r

Важно отметить, что возрастание резистентности к Van сопровождается появлением устойчивости и к ряду других антибиотиков, обладающих различными механизмами антибактериального

Таблица. Фенотипическая резистентность исследованных штаммов

действия. Характеристика чувствительности к антибиотикам исследованных штаммов представлена в таблице.

Штаммы

Антибиотики

Бен

Ген

Цеф

Тет

Лин

Окс

Риф

Эр

Фуз

Лев

Ван

Цип

S.epidermisis 33

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

S.epidermisis 33 Vanr

У

Ч

Ч

П

У

У

П

Ч

У

Ч

У

Ч

Прим. Обозначения устойчивости к антибиотикам: У – устойчивый, П – промежуточный, Ч – чувствительный. Антибиотики: Бен – бензилпенициллин, Ген – гентамицин, Цеф – цефалексин, Тет – тетрациклин, Лин – линкомицин, Окс – оксациллин, Риф – рифампицин, Эр – эритромицин, Фуз – фузидин, Лев – левомицетин, Ван – ванкомицин, Цип – ципрофлоксацин

Большинство известных изолятов стафилококков, гетерорезистентных к Van, являются одновременно метициллин- или оксациллинрезистентны-ми, таким образом, устойчивость к Van часто связана с устойчивостью к оксациллину. Возможно, устойчивость к Van обусловлена изменениями в метаболизме клеточных стенок, что в свою очередь влияет на активность бета-лактамных антибиотиков. Экспрессия Vanr-фенотипа стафилококков не ограничивается резистентностью только к бета- лактамам, так как все они обладают различными уровнями резистентности ко многим антибиотикам [19].

После 20 последовательных пассажей на питательной среде без антибиотика Vanr-штамм сохранял высокий уровень устойчивости к Van и оставался устойчивым и к другим антибиотикам. Важно отметить, что исследования других авторов указывают на специфические особенности работы с резистентными штаммами стафилококков из-за ревертирования ванкомицинчувствительного фенотипа многих изолятов [13].

Как показало исследование поверхности клеток методом бактериальной адгезии к углеводородам, штамм S.epidermidis 33 обладает гидрофобной поверхностью. Показатель гидрофобности его поверхности составляет 45±10 %, в то же время поверхность Van^r-штамма менее гидрофобна и составляет лишь 11±4 %.

Анализ липидов клеточных мембран изучаемых штаммов выявил значительные различия в их качественном и количественном составе. Как показано на рис. 2, развитие резистентности к Van сопровождается увеличением относительного количества кардиолипина и фосфатидилглицерина в составе липидов мутантного штамма с одновременным снижением количества гликолипидов. Следует отметить появление лизилфосфатидилглицерина и лизоформ фосфолипидов, отсутствующих в составе липидов исходного штамма S.epidermidis 33. Накопление кардиолипина в клетках резистентного штамма, возможно, являясь результатом адаптации к стрессовым условиям, компенсирует нарушение жесткости клеточной стенки и ингибирует аутолиз клеток [15], а появление лизилфосфатидилглице-рина вызывает изменение заряда клеточных поверхностей, приводя к накоплению положительных зарядов на цитоплазматической мембране, что в свою очередь снижает чувствительность производного штамма к катионному пептиду варнерину. Определение МПК низкомолекулярного пептида варнерина показало возрастание устойчивости Vanr-штамма к данному антибактериальному пре- мкг/мл, что значительно превышает МПК варнери-на родительского штамма S.epidermidis 33, равную 0,25 мкг/мл.

Рис. 2. Тонкослойная хроматография полярных липи-

дов S.epidermidis 33 и S.epidermidis 33 Van^r.

Прим.: 1 – S.epidermidis 33, 2 – S.epidermidis 33 Van^r; I – моноглюкозилдиглицерид, II – кардиолипин, III – диглюкозилдиглицерид, IV - фосфатидилглицерин, V – лизилфосфа-тидилглицерин, VI – лизоформы фосфолипидов

Лизис клеток S.epidermidis 33 и S.epidermidis 33 Van^r под действием варнерина в концентрации 1 мг/мл в трис HCl-буфере, pH 7.2 в течение 4 ч показал более медленное снижение оптической плотности и количества жизнеспособных клеток в суспензии мутантного штамма (рис. 3), но несмотря на это, суспензии обоих штаммов через 24 ч не содержали живых клеток.

Таким образом, возникновение устойчивости штамма S.epidermidis 33 к Van вызвает изменение важных физиологических свойств данного микроорганизма. При этом снижение чувствительности к низкомолекулярному катионному пептиду варне-рину, возможно, происходит вследствие изменения уровня гидрофобности бактериальной поверхности, а также вследствие адаптивного накопления полярных липидов клеток.

парату – МПК варнерина для него составляет ≥8

Рис. 3. Изменение оптической плотности (А) и КОЕ (Б) клеточных суспензий S.epidermidis 33 и S.epidermidis 33 Van^r под действием катионного пептида варнерина. Прим.: 1 – инкубация S.epidermidis 33 в трис-буфере, 2 – инкубация S.epidermidis

33 в присутствии варнерина в трис-буфере, 3 – инкубация S.epidermidis 33 Van^r в трис-буфере, 4 – инкубация S.epidermidis

33 Vanr в присутствии варнерина в трис-буфере