Изменение динамики активности аспартат и аланинаминотрансфераз при прорастании семян ячменя (Hordeum vulgare L.)

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 577.1                                           

Прорастание сложный признак, на который влияет множество генетических, эндогенных и экологических факторов [1]. Прорастание обусловлено множеством клеточных процессов, включая активацию клеточного цикла. Все эти процессы поддерживаются запуском центрального метаболизма для получения энергии и производства строительных веществ [2].

Семена растений содержат высокую концентрацию запасов питательных веществ, которые служат источником сырья для роста проростка. Аминокислоты частично присутствуют в свободном виде в не проросших семенах. Они в основном образуются в результате протеолиза во время прорастания, при котором запасы белка гидролизуются для получения питательных веществ для молодого проростка. В процессе прорастания происходит значительное взаимопревращение аминокислот, обусловленное метаболическими событиями, требованиями транспортной системы и различиями между аминокислотным составом резервных белков по сравнению с новыми цитоплазматическими белками [3]. Поэтому трансаминирование, вероятно, участвует в начальном метаболизме свободных аминокислот. Показано, что существует несколько аминотрансфераз, которые используют широкий спектр амино- и кетокислот [4]. Среди них известны аспартат (АcАТ) и аланин аминотрансферазы (АлАТ).

Аланин аминотрансфераза (АлАТ, КФ 2.6.1.2) катализирует обратимую реакцию превращения аланина и 2-оксоглутарата в пируват и глутамат. Этот пиридоксальфосфат-зависимый фермент играет ключевую роль в метаболизме растений, связывая первичный углеродный обмен с синтезом аминокислот [5, 6].

Аспартат аминотрансфераза (АcАТ, КФ 2.6.1.1) катализирует обратимую реакцию трансаминирования между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом с образованием оксалоацетата и L-глутамата [4, 7].

Ячмень ( Hordeum vulgare L.) — важная зерновая, продовольственная и кормовая культура занимающая четвертое место в мировом производстве среди зерновых культур после кукурузы, риса и пшеницы, выращивается во всем мире, в самых разных условиях [8– 10].

Аспартат- и аланин-аминотрансферазы играют важную роль в метаболизме прорастающего зерна ячменя, и их активность тесно связана с биохимическими изменениями, происходящими в процессе прорастания. В целом изучение динамики активности этих ферментов в прорастающем зерне является важным направлением исследований, позволяющим понять метаболические пути и механизмы регуляции, управляющие прорастанием зерна ячменя.

Материалы и методы исследования

Для исследования были отобраны два сорта ячменя хранящихся в генофонде НИИСХ Минсельхоза: «Даянатли» и «Бахарлы». Семена инкубировали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 22±3 °С. Семена ячменя гомогенизировали в растворе 1:4, содержащем 100 мМ, Трис-HCl (рН 7,8), 10 мМ MgCl 2 , 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 1% поливинилпирролидона. Гомогенат центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов.

Активность ферментов определяли спектрофотометрически, по методике, Альфонсо и Брюггеману [11], с небольшими изменениями. Для определения активности аспартатаминотрансферазы реакционная среда состояла из 100 мМ Трис-HCl (pH 7,8), 2 мМ ЭДТА, 2,5 мМ 2-оксоглутарата, 10 мкг/мл пиридоксальфосфата, 10 мМ ДТТ, 12 U/мл малатдегидрогеназы, 0,2 мМ НАДН. Реакцию начинали добавлением в среду 2,5 мМ L-аспартата. Для активности аланинаминотрансферазы малатдегидрогеназу заменяли лактатдегидрогеназой и реакцию начинали добавлением в среду 10 мМ L-аланина [11]. Количество белка определяли по методу Брэдфорда [12].

Все эксперименты были выполнены в 3-x повторностях и погрешности определяли с использованием программы статистического анализа Student’s t-test. Различия между средними значениями считались достоверными при значениях Р <0,01, 0,005.

Результаты и обсуждение

Активность аланинаминотрансферазы на 4-м часе прорастания у сорта Бахарлы составила 5,49 мкмоль×мин-1×мг белок-1. На 12-м часе активность фермента увеличилась в 1,3 раза по сравнению с 4 часом, а на 24-м часе — в 2,8 раза. Наибольшая активность фермента наблюдалась на 2 сутки (18,21 мкмоль×мин-1×мг белок-1). Постепенное снижение активности фермента наблюдалось на 4 и 6 сутки (Рисунок 1).

-Ен ID

4     12     24     48     96    144

Рисунок 1. Динамика активности аланин аминотрансферазы у сорта ячменя Бахарлы в процессе прорастания семян

У сорта Даянатли активность фермента на 4-м часе прорастания составила 3,787 мкмоль×мин-1×мг белок-1. По сравнению с этим активность фермента была в 1,64 раза выше на 12-й час, в 5,2 раза выше на 24-й час и в 4,83 раза выше на 2-й день прорастания. На 4-е и 6-е сутки активность фермента составила 14,40 и 3,52 мкмоль×мин-1×мг белок-1 соответственно. Результаты показывают, что активность фермента аланинаминотрансферазы была выше у сорта Даянатли на 24-м часу (Рисунок 2).

Рисунок 2.

Динамика активности аланин аминотрансферазы

Время прорастания, часы

у сорта ячменя Даянатли в процессе прорастания семян

Динамика изменения активности фермента АсАТ показала, что фермент проявлял более высокую активность у обоих сортов ячменя по сравнению с аланинаминотрансферазой.

Активность фермента у сорта Бахарлы на 4-м часе прорастания составила 15,92 мкмоль×мин-1×мг белок-1. Активность фермента была в 1,14 раза выше через 12 часов, чем через 4 часа, в 1,47 раза выше через 24 часа и в 1,39 раза выше через 48 часов. На 96-м и 144-м часу активность фермента составила 16,26 мкмоль×мин-1×мг белок-1 и 7,52 мкмоль×мин-1×мг белок-1соответственно.

Активность фермента аспартатаминотрансферазы составила 18,68 мкмоль×мин-1×мг белок-1 на 4-м часе прорастания у сорта Даянетли. На 12-м часе активность фермента была выше в 2,3, на 24-м часе — в 2,52, на 48-м часе — в 2,05, на 96-м часе — в 1,19 раза чем на 4м часе. К концу исследуемого периода активность фермента начала постепенно снижаться (13,52 мкмоль×мин-1×мг белок-1). На основании полученных результатов сравнение сортов Бахарли и Даянатли показало, что оба фермента проявили более высокую активность у сорта Даянатли. Активность фермента аспартатаминотрансферазы была выше у обоих сортов по сравнению с аланинаминотрансферазой (Рисунок 3, 4).

Динамика активности аспартат аминотрансферазы у

Рисунок 3.

сорта ячменя Бахарлы в

процессе прорастания семян

Время прорастания, часы

Рисунок 4. Динамика активности аспартат аминотрансферазы у сорта ячменя Даянатли в процессе прорастания семян

В ряде исследований было показано, что аминокислоты могут служить альтернативным субстратом для производства энергии в прорастающих семенах [13–15]. Пулы свободных аминокислот накапливаются в сухих семенах для использования в первые часы после прорастания. Во время стратификации уровень большинства аминокислот снижается [16]. Во время прорастания зерна ячменя происходят различные физиологические и биохимические изменения, способствующие росту проростков. Эти изменения сопровождаются активацией ряда ферментов, в том числе АсАТ и АлАТ, которые участвуют во взаимопревращении аминокислот. В результате изучения ферментов АсАТ и АлАТ установлено, что активность обоих ферментов в прорастающих зернах ячменя может изменяться в зависимости от различных факторов, таких как стадия прорастания, условия окружающей среды и генетические факторы. Активность обоих ферментов повышается на ранних стадиях прорастания, что указывает на их роль в метаболизме аминокислот для поддержания роста проростков.

Заключение

Согласно полученным результатам АсАТ и АлАТ являются важными ферментами, участвующими в аминокислотном обмене при прорастании зерна ячменя, играя решающую роль во взаимопревращении аминокислот и обеспечивая необходимые биохимические изменения для поддержания роста проростков.