Изменение иммунологических и продуктивных показателей у цыплят-бройлеров под влиянием биологически активных веществ из экстракта коры дуба

Использование антибиотиков как стимуляторов роста в кормах для животных ограничено из-за распространения резистентности у зоонозных бактериальных патогенов, что создает угрозу здоровью населения (1, 2). В настоящее время увеличивается число исследований, посвященных поиску

Эксперименты проводили на оборудовании Центра коллективного пользования Всероссийского НИИ мясного скотоводства (ВНИИМС). Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 16-16-10048).

альтернативных противомикробных веществ с профилактическим и ростостимулирующим действием, не вызывающих бактериальной резистентности и побочных эффектов у животных.

Фитогенные соединения (1, 3-5) широко признаны в качестве потенциальной альтернативы антибиотикам в кормах. Это биологически активные соединения растительного происхождения с положительным влиянием на рост и здоровье животных, которые часто применяются в виде эфирных масел и экстрактов трав (6). В то же время результаты исследований, посвященных раскрытию механизмов действия фитогенных соединений, возможных побочных эффектов и экономической эффективности, пока неубедительны. Имеются данные, подтверждающие способность фи-тогенных соединений, включая экстракты из семян люцерны (7), трав (8) и эфирных масел (9, 10) влиять на quorum sensing (QS) бактерий. Однако все они получены в исследованиях in vitro и касаются пищевых продуктов. Ингибирование QS для профилактики и борьбы с бактериальными инфекциями у сельскохозяйственных животных остается малоизученной проблемой, за исключением аквакультуры (11).

Одно из препятствий для применения фитогенных соединений — нестабильный химический состав экстрактов растений, зависящий от условий произрастания, ареала и других факторов. Ранее было обнаружено несколько соединений из экстракта коры дуба ( Quercus cortex), обладающих как антибактериальной, так и анти-QS-активностью (12, 13). Эти вещества использовали в эксперименте на сельскохозяйственной птице.

В представленной работе впервые показано, что включение композиции биологически активных веществ из экстракта Quercus cortex в рацион цыплят-бройлеров кросса Смена 8 способствует поддержанию продуктивности и усилению иммуномодулирующего состояния организма.

Целью нашего эксперимента было изучение влияния разных доз биологически активных веществ из экстракта Quercus cortex на продуктивные показатели и иммунитет цыплят-бройлеров, оценка перспектив применения таких соединений и возможного механизма их действия.

Методика. Идентификацию химических веществ выполняли на газовом хроматографе с масс-селективным детектором GQCMS 2010 Plus («Shimadzu», Япония) на колонке HP-5MS. При интерпретации результатов использовали программное обеспечение GCMS Solutions, GCMS PostRun Analysis, для идентификации соединений — набор библиотек спектров CAS, NIST08, Mainlib, Wiley9 и DD2012 Lib. Количественное присутствие отдельных идентифицированных компонентов оценивали по соотношению (%) площади пика и общей площади экстракта.

В эксперименте использовали смесь веществ, выделенных из экстракта коры дуба ранее (12, 13) и синтезированных искусственно («Acros Organics B.V.B.A.», Бельгия): 2-н-пропилрезорцинол (98 %), 4-гидрокси-3-метоксибензальдегид (99 %), 7-гидроксикумарин (99 %), 3,4,5-триметоксифенол (98,5 %), скополетин (95 %), конифериловый спирт (98 %). Анти-QS-эффект этой композиции веществ (КВ) подтверждали с использованием штамма Chromobacterium violaceum CV026 при диффузии в агар (качественно) и методом серийных разведений в жидкой питательной среде (количественно).

Для опытов в условиях вивария отобрали 120 цыплят-бройлеров кросса Смена 8 в возрасте 7 сут, которых методом аналогов разделили на 4 группы (по n = 30). Во время эксперимента вся птица находилась в одинаковых условиях кормления и содержания. Рационы составлялись с учетом рекомендаций ВНИТИП (14). Контрольная группа получала основной 386

рацион (ОР); I опытная — ОР + композицию веществ (КВ) 1 (1 мл/кг живой массы); II опытная — ОР + КВ 2 (2 мл/кг живой массы); III опытная — ОР + КВ 3 (3 мл/кг живой массы). Количественное содержание химических веществ в композиции составляло для I группы: 2-н-пропилрезор-цинол — 1,5 мг/мл, 4-гидрокси-3-метоксибензальдегид — 0,5 мг/мл, 7-гидроксикумарин — 0,5 мг/мл, 3,4,5-триметоксифенол — 2 мг/мл, скополе-тин — 0,3 мг/мл, конифериловый спирт — 4,5 мг/мл; для II группы — соответственно 3; 1; 1; 4; 0,6; 9 мг/мл; для III группы — 4,5; 1,5; 1,5; 6; 0,9; 13,5 мг/мл. Птицу кормили 2 раза в сутки, учет поедаемости корма проводили ежесуточно, КВ давали индивидуально в виде раствора. Поение осуществлялось вволю. Оценивали рост и развитие цыплят (осмотр и индивидуальные взвешивания проводили ежедневно, утром в одно и то же время). Декапитацию птицы под нембуталовым эфиром осуществляли на 42-е сут. Содержание птицы и процедуры при выполнении экспериментов соответствовали требованиям инструкций и рекомендациям российского регламента (Приказ МЗ СССР ¹ 755 от 12.08.1977) и «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals» (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить число используемых образцов.

Образцы крови для гематологических исследований отбирали в вакуумные пробирки с антикоагулянтом (EDTA-К3), для биохимических исследований — в вакуумные пробирки с активатором свертывания (тромбин). Гематологические показатели (число и вид лейкоцитов) учитывали на автоматическом гематологическом анализаторе URIT-2900 Vet Plus («URIT Medical Electronic Group Co., Ltd», Китай).

Статистическую обработку проводили в программе IBM SPSS Statistics Version 20 . Рассчитывали средние (М) и стандартные ошибки средних (±SEM). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты. Анализ морфологических и биохимических показателей крови выявил изменения в опытных группах относительно контроля (табл. 1). Так, число лейкоцитов возросло на 19,2-28,5 % (Р ≤ 0,05), лимфоцитов в I, II и III группах — соответственно на 24,4; 36,2 (Р ≤ 0,05) и 44,0 % (Р ≤ 0,05), моноцитов — на 23,5; 23,5 и 29,4 % (Р ≤ 0,05), гранулоцитов — на 12,3 (Р ≤ 0,05); 5,7 и 9,5 %.

1. Содержание (½10⁹/л) белых клеток в крови у цыплят-бройлеров кросса Смена 8 при введении композиции веществ (экстракт из коры дуба + искусственно синтезированные вещества) per os ( M ±SEM, условия вивария)

Показатель	Группа
	контрольная ( n = 15)	I опытная ( n = 15)	II опытная ( n = 15)	III опытная ( n = 15)
Лейкоциты	24,9±1,21	29,7±1,33*	30,5±1,08*	32,0±1,51*
Лимфоциты	12,7±0,91	15,8±1,18	17,3±1,58*	18,3±1,11*
Моноциты	1,7±0,77	2,1±1,81	2,1±0,54	2,2±0,53*
Гранулоциты         10,5±0,91 П р и м е ч а н и е. Описание групп см. * Различия с контролем статистически		11,8±0,21* в разделе «Методика». значимы при Р ≤ 0,05.	11,1±0,94	11,5±1,34

Гематологические параметры служат удобным показателем для оценки физиологического состояния и здоровья животных и могут быть полезны для получения информации об эффектах кормовых добавок (15). Наши данные согласуются с результатами исследований, выполненных ранее (16, 17). Кроме того, в других исследованиях на животных in vitro показано, что биологически активные соединения из растений увеличивают иммунологическую активность за счет увеличения фагоцитоза (18). Этим также можно объяснить повышение показателей крови в опытных группах.

Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови во II и III опытных группах превышала аналогичный показатель в контроле на 13,2 % (Р ≤ 0,05). Количество аспартатаминотрансферазы (АсАТ) было наименьшим в I опытной группе (Р ≥ 0,05) (табл. 2).

2. Активность ферментов сыворотки крови и показатели неспецифического иммунитета у цыплят-бройлеров кросса Смена 8 при введении композиции веществ (экстракт из коры дуба + искусственно синтезированные вещества) per os ( M ±SEM, условия вивария)

Показатель	Группа
	контрольная ( n = 15)	I опытная ( n = 15)	II опытная ( n = 15)	III опытная ( n = 15)
АлАТ, IU/л	3,8±0,76	4,0±0,36	4,3±0,43*	4,3±0,37*
АсАТ, IU/л	228,8±21,84	219,6±12,53	229,9±13,23	231,8±15,51
γ -ГТ, IU/л	16,5±1,04	18,3±2,85	15,0±1,08	16,0±2,00
ЛДГ, IU/л	14,2±3,68	14,0±5,57	11,7±2,99*	11,0±2,97*
СОД, %	218,6±54,02	427,1±52,52*	391,1±38,80*	378,1±51,33*
Каталаза, мкмоль Н2О2•л - 1• мин - 1	989,4±46,30	1438,0±57,73*	1701,6±53,33*	1468,5±52,91*
ЛАСК, %	47,1±0,39	45,3±0,91	44,9±1,2	45,1±0,55
β -Лизины, %	72,9±0,40	89,3±0,80*	69,6±0,52	84,5±0,51

П р и м еч а ни е. АлАТ — аланинаминотрансфераза, АсАТ — аспартатаминотрансфераза, γ -ГТ — γ -глута-милтранспептидаза, ЛДГ — лактатдегидрогеназа, СОД — супероксиддисмутаза, ЛАСК — лизоцимная активность сыворотки крови. Описание групп см. в разделе «Методика».

*Различия с контролем статистически значимы при Р ≤ 0,05.

Ранее отмечалось (19), что скармливание полифенольных веществ бройлерам в составе рациона не оказало значительного влияния на показатели АсАТ и АлАТ, но при этом не был установлен точный состав веществ. В используемой нами композиции значительную долю занимал ко-нифериловый спирт, обладающий цитотоксическим эффектом (20), который он мог оказать на клетки печени, что заметно по показателям АсАТ и АлАТ во II и III опытных группах. Содержание γ -глутамилтранспептидазы ( γ -ГТ) уменьшалось во II и III опытных группах на фоне снижения количества лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на 17,6-22,5 % (Р ≤ 0,05) в сравнении с контролем. Полученные данные косвенно указывают на положительное действие композиции веществ в начальной концентрации на белковый и углеводный обмен. Аналогичный эффект наблюдали в своих исследованиях H.Y. Qiao с соавт. (20) после скармливания бройлерам 4-гидрокси-3,5-диметокси-коричной кислоты (полифенольного вещества), которое также не оказывало влияния (P > 0,05) на сывороточную активность креатинки-назы и лактатдегидрогеназы. Кроме того, известно (21), что экстракт дуба способствует улучшению толерантности к глюкозе и значительно уменьшает ее абсорбцию через кишечный эпителий.

Поступление КВ с кормом сопровождалось повышением антиоксидантной активности, в частности увеличением содержания супероксид-дисмутазы (СОД) в крови у цыплят из опытных групп, причем наибольшую концентрацию отмечали в I опытной группе (95,3 %). Количество каталазы у птицы в опытных группах также оказалось выше, чем в контроле, на 45,3-71,9 % (Р ≤ 0,05). Из источников литературы известно об антиоксидантных характеристиках экстрактов дуба (22, 23), что, вероятно, проявилось и в наших опытах. Увеличение общей антиоксидантной активности и количества СОД в плазме крови наблюдалось в ранее проведенных экспериментах (24, 25) при скармливании добавок галловой кислоты (одного из компонентов дубовой коры). При скармливании источника полифенольных веществ (порошок из семян винограда) тоже отмечали увеличение концентрации каталазы в крови у цыплят бройлеров (19).

Включение в рацион КВ способствовало увеличению количества β- лизинов в сыворотке крови у бройлеров из I группы на 16,4 % относительно контроля (Р ≤ 0,05). Прирост живой массы птицы в I опытной группе увеличивался в сравнении со II и III группами до 15,0 % (Р ≤ 0,05) через 1 нед, до 14,3 % через 2 нед и до 12,6-13,9 % через 3 и 4 нед. Усиление роста птицы в I опытной группе происходило на фоне 100 % сохранности поголовья в отличие от остальных групп, где показатель составил 71-85 % (табл. 3).

3. Динамика живой массы (г) у бройлеров кросса Смена 8 при введении композиции веществ (экстракт из коры дуба + искусственно синтезированные вещества) per os ( n = 30, M ±SEM, условия вивария)

Группа	]      1-я нед	]     2-я нед	3-я нед	4-я нед
Контроль	299,5±15,4	652,5±28,9	1164,0±21,5	1787,0±22,2
I опытная	317,2±12,5	618,8±23,5	1134,4±17,2	1660,0±23,5
II опытная	275,6±20,1	541,0±23,2*	1007,0±22,7	1571,5±26,8
III опытная	291,6±10,7	558,4±11,3	1015,2±12,4	1456,8±19,5*
П р и м е ч а н и е.	Описание групп см.	в разделе «Методика».
* Различия с контролем статистически значимы при Р ≤ 0,05.

Использование биологически активных веществ в первоначальной концентрации (I опытная группа) привело к увеличению живой массы птицы по завершении эксперимента (42-е сут) на 1,9 % (Р ≥ 0,05) в сравнении с контрольной группой. Это согласуется с данными о том, что включение в состав рациона цыплят-бройлеров диетических добавок галловой кислоты и богатых полифенолом виноградных семян положительное влияло на показатели роста (19, 20). Использованная нами композиция веществ также содержит фенольные соединения, поэтому результаты исследований можно сравнивать объективно.

В то же время известны работы, в которых применение β -резор-циловой кислоты в качестве антимикробной кормовой добавки не вызвало значительного прироста живой массы у цыплят-бройлеров (26). В наших исследованиях наблюдалось снижение живой массы во II и III опытных группах (при увеличении концентрации биологически активных веществ), при этом в композиции присутствовал близкий по происхождения компонент пропилрезорцинол. Что касается эффекта стимуляции роста, то некоторые возможные механизмы, согласно данным литературы, включают снижение общей бактериальной нагрузки, подавление патогенных микроорганизмов, истончение слоя слизистых оболочек, а также прямой модуляции иммунной системы (27). Известно, что дубильные вещества могут быть вовлечены в модуляцию состава и активности микрофлоры кишечника и ее взаимодействия с поступающими соединениями. Как сообщалось, грамположительные бактерии более чувствительны к растительным экстрактам, богатым таниноподобными веществами (28, 29). Это подтверждается и свойствами соединений, найденных ранее в экстракте Quercus cortex (12, 13).

Таким образом, скармливание цыплятам-бройлерам композиции веществ (экстракт из коры дуба + искусственно синтезированные вещества) в дозе 1 мл/кг живой массы благоприятно сказывается на иммуномодулирующем состоянии и антиоксидантной активности организма, что сопровождаются увеличением содержания β -лизинов, супероксиддисму-тазы и каталазы в сыворотке крови, увеличением сохранности птицы до 100 % и продуктивности до 15 %.