Изменение экспрессии генов в створках нативных клапанов сердца, пораженных инфекционным эндокардитом

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ / EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS

Инфекционный эндокардит (ИЭ) – заболевание, приводящее к нарушению функции клапанов сердца и занимающее одну из лидирующих позиций среди причин смертности населения. Развитие ИЭ – многофакторный процесс, компоненты которого определяют течение и исход данного заболевания. Несмотря на то, что заболеваемость ИЭ не высока, данное патологическое состояние представляет собой жизнеугрожающее заболевание с высокой степенью развития осложнений [1].

Зачастую развитие ИЭ ассоциировано с бактериальной инфекцией, которая изначально поражает эндокардиальную поверхность сердца. Течение ИЭ зависит от активности воспалительного процесса, патогена, а также от реакции организма пациента [2]. Среди патогенов, поражающих клапанные структуры сердца, в большинстве случаев превалирует золотистый стафилококк, проникающий в эндотелиальные клетки, что впоследствии может приводить к повреждению эндотелиального слоя. Повреждение эндотелия стимулирует образование фи-брин-тромбоцитарных агрегатов, без воспалительного процесса и бактерий. Кроме того, эндокард активно экс- прессирует интегрины, создавая адгезивную поверхность для циркулирующих патогенов [3]. Кроме того, стоит отметить, что эндотелиальные клетки наиболее чувствительны к различным повреждающим факторам, таким как свободные радикалы, воспалительные белки и др.

Молекулярно-генетические исследования развития ИЭ в основном сосредоточены на изучении однонуклеотидных замен. Так, ранее нашей научной группой показано, что полиморфные варианты rs1143634 гена IL1b, rs3212227 гена IL12 и rs1130864 гена CRP обладают про-тективным эффектом в отношении развития ИЭ [4]. Также отмечено, что экспрессия провоспалительных цитокинов более выражена в створках нативных клапанов сердца, пораженных ИЭ, по сравнению с другой клапанной патологией. Ю.С. Бахарева и соавт. в своем исследовании показали значимую роль генов, кодирующих матриксную металлопротеиназу 9 и эндотелиальную синтазу азота, в отношении развития эндокардитов как инфекционной, так и неинфекционной природы [5]. Отмечается, что молекулы межклеточной адгезии, представляющие собой мембранные рецепторы, играют важную роль как в нормальных, так и в патофизиологических процессах, связанных с транспортом и взаимодействием между клетками. Кроме того, C. Golias и соавт. в своем обзоре, опубликованном в 2011 г., предложили идею о том, что молекулы клеточной адгезии играют важную роль в патофизиологии ИЭ [6]. В работах отечественных исследователей установлена роль эндотелиальной дисфункции при инфекционном эндокардите [7]. В одной из наших работ, также показано, что минорный аллель Т полиморфного варианта rs5370 EDN1 ассоциирован с увеличением риска развития ИЭ [8]. Таким образом, на основании литературных данных нами была сформулирована цель исследования, которая заключалась в оценке вклада генов SOD1, CAT, PXDN1, NOS3, EDN1, VCAM, ICAM, PECAM, SELE и SELP в патогенез инфекционного эндокардита у пациентов, перенесших кардиохирургическое вмешательство.

Материал и методы

В исследование включены 25 пациентов (средний возраст – 55 лет) с уточненным диагнозом «инфекционный эндокардит» и 12 пациентов (средний возраст – 62 года) с другой клапанной патологией, проходивших лечение на базе НИИ КПССЗ (Кемерово). Исследование одобрено локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ. Все участники подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Сбор материала и выделение РНК

Для избегания деконтаминации все рабочие поверхности были обработаны раствором для деконтаминации RNaseZapTM RNase Decontamination Solution (Invitrogen, США).

Полученный участок створки клапана лизировали в 900 мкл реагента TRIzol (Invitrogen, США) с последующей гомогенизацией ткани. Выделение РНК осуществляли коммерческим набором компании Qiagen в соответствии с предоставляемым протоколом производителя (Qiagen, кат. номер: 74104, Германия). При помощи спектрофотометра Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen, США) определяли целостность выделенной РНК, а также ее количество и качество. Выделенные образцы РНК хранили при температуре –80 °C.

Проведение кПЦР

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили при помощи реакции обратной транскрипции коммерческим набором в соответствии с протоколом производителя (Applied Biosystems, кат. номер: 4374967, США). На спектрофотометре NanoDropTM 2000 (ThermoScientific, США) проводили оценку качества и количество синтезированной кДНК. До начала следующего этапа эксперимента синтезированную кДНК хранили при температуре –20 °C.

Экспрессию генов PXDN1, NOS3, EDN1, VCAM, ICAM, PECAM, SELE, SELP оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с флуоресцентным красителем SYBR Green (таблица), а генов SOD1, CAT – с помощью кПЦР с праймерами TaqMan^TM Gene Expression Assays (Applied Biosystems, США) на амплификаторе ViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США).

Таблица. Характеристика праймеров, использованных в эксперименте Table. The characteristics of primers used in the experiment

Ген Gene	Последовательность/Референсный номер Sequence/Reference number	Белок Protein
ACTB	Прямой/Forward: 5’-CATCGAGCACGGCATCGTCA-3’ Обратный/Reverse: 5’-TAGCACAGCCTGGACAGCAAC-3’	Актин/Actin
GAPDH	Прямой/Forward: 5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’ Обратный/Reverse: 5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’	Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа/ Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
B2M	Прямой/Forward: 5’-TCCATCCGACATTGAAGTTG-3’ Обратный/Reverse: 5’- CGGCAGGCATACTCATCTT-3’	Микроглобулин бета-2/Beta-2-microglobulin
VCAM1	Прямой/Forward: 5’- CGTCTTGGTCAGCCCTTCCT-3’ Обратный/Reverse: 5’-ACATTCATATACTCCCGCATCCTTC-3’	Молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 Vascular cell adhesion protein 1
ICAM1	Прямой/Forward: 5’-TTGGGCATAGAGACCCCGTT-3’ Обратный/Reverse: 5’-GCACATTGCTCAGTTCATACACC-3’	Молекула межклеточной адгезии 1-го типа Intercellular adhesion molecule 1
PECAM1	Прямой/Forward: 5’-AAGGAACAGGAGGGAGAGTATTA-3’ Обратный/Reverse: 5’-GTATTTTGCTTCTGGGGACACT-3’	Молекула адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам/Platelet endothelial cell adhesion molecule
SELE	Прямой/Forward: 5’-ACCCTGGCTTCAGTGGACTC-3’ Обратный/Reverse: 5’-TGCTTGGCAGGTAACCCCTAT-3’	Е-селектин/E-selectin
SELP	Прямой/Forward: 5’-ATGGGTGGGAACCAAAAAGG-3’ Обратный/Reverse: 5’-GGCTGACGGACTCTTGATGTAT-3’	Р-селектин/P-selectin
EDN1	Прямой/Forward: 5’-TGCCACCTGGACATCATTTGG-3’ Обратный/Reverse: 5’-GTCTGTTGCCTTTGTGGGAAG-3’	Эндотелин 1/Endothelin-1
NOS3	Прямой/Forward: 5’-GTGATGGCGAAGCGAGTGAAG-3’ Обратный/Reverse: 5’-CCGAGCCCGAACACACAGAAC-3’	Эндотелиальная синтаза азота Nitric oxide synthase, endothelial
PXDN	Прямой/Forward: 5’-AGCCAGCCATCACCTGGAAC-3’ Обратный/Reverse: 5’-TTCCGGGCCACACACTCATA-3’	Пероксидазин/Peroxidasin homolog
CAT	Hs00156308_m1	Каталаза/Catalase
SOD1	Hs00533490_m1	Супероксиддисмутаза 1/Superoxide dismutase

На каждый образец готовили 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл мастер-микса PowerUp TM SYBR ® Green Master Mix (Applied Biosystems, США), смесь прямого и обратного праймеров в конечной концентрации

500 нМ и 10 нг кДНК. ПЦР проводили в 96-луночной оптической плашке, содержащей помимо анализируемых образцов пять стандартов с двукратным разведением и отрицательный контроль (реакционная смесь без кДНК).

Каждый исследуемый образец, стандарт и отрицательный контроль анализировали в трех технических повторах. Амплификацию осуществляли по следующей схеме: 2 мин при 50 °C, 2 мин при 95 °C, 15 с при 95 °C и 1 мин при 60 °C (40 циклов). Специфичность и эффективность реакции проверяли путем анализа кривых плавления и графиков амплификации в программе QuantStudio^TM Real-Time PCR Software v.1.3 (Applied Biosystems, США). Результаты кПЦР нормировали с помощью трех референсных генов ACTB , GAPDH , B2M (см. таблицу) в соответствии с имеющимися рекомендациями. Экспрессию изучаемых генов рассчитывали по методу 2^-ΔΔСt и выражали в виде кратного изменения относительно контрольных образцов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Из замороженных образцов на криотоме Microm HM 525 (Thermo Scientific, США) изготавливали срезы толщиной 8 мкм, которые окрашивали с применением специфических первичных антител к нитротирозину (кат. номер: 39B6). На образцы с антителами к нитротирозину наносили смесь вторичных антител к IgG осла, конъюгированные с AlexaFluor555 (A-31570, Invitrogen, США). Все срезы докрашивали ядерным красителем DAPI (Sigma-aldrich, США). Автофлуоресценцию удаляли с помощью реагента Autouorescence Eliminator Reagent (Millipore, США) согласно инструкции производителя и заключали в ProLong (LifeTechnologies, США) под покровное стекло. Исследование препаратов осуществляли на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 700 (Carl Zeiss, Германия).

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программы GraphPad Prism 8 (Graph Pad Software,). Нормальность распределения оценивали при помощи теста Колмогорова – Смирнова, Шапиро – Уилка. В случае если распределение отклонялось от нормального, сравнение двух групп проводили при помощи критерия Манна – Уитни. Сравнение более двух групп осуществляли с помощью теста Краскела – Уоллиса. Результаты считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

В проведенном исследовании выделены образцы РНК (диапазон концентраций – от 168,7 до 247,1 нг/мкл) с высоким уровнем чистоты (А260/230 > 1,90; А260/280 > 2,00; RIQ индекс > 9,5). На основе полученных образцов РНК синтезировано более 1500 нг/мкл кДНК (А260/230 > 1,90 и А260/280 > 1,80).

Сравнительный анализ экспрессии генов PXDN1 , SOD1 и CAT, а также NOS3 и EDN в створках нативных клапанов пациентов с ИЭ и контролем показал, что уровень мРНК в створках, пораженных ИЭ, был статистически значимо ниже по сравнению с контролем (рис. 1).

Стоит отметить, что экспрессия генов VCAM и SELP также статистически значимо снижена в створках, пораженных ИЭ, по сравнению с контрольными образцами (рис. 2). Достоверных различий по другим генам получено не было.

Рис. 1. Уровень экспрессии PXDN1 , SOD1 , CAT, NOS3, EDN1

Fig. 1. The expression levels of PXDN1 , SOD1 , CAT, NOS3, EDN1

Рис. 2. Экспрессия генов VCAM, ICAM, PECAM, SELE, SELP Fig. 2. The expression levels of VCAM, ICAM, PECAM, SELE, SELP

При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к нитротирозину показано, что створки клапанов отличались по уровню экспрессии данного белка. Так, в створке клапана, пораженного ИЭ, наблюдалось более слабое окрашивание нитротирозином (1) по сравнению с контрольными образцами клапанов (2–4), рисунок 3.

Нитротирозин /DAPI Nitrotyrosine /DAPI

Рис. 3. Изображение конфокальной микроскопии нативных створок клапанов сердца, а – окраска на нитротирозин (красный) и DAPI (синий), цифрами обозначены образцы клапанов: 1 – клапан, пораженный ИЭ; 2, 3, 4 – клапаны без ИЭ; б – количественный анализ изображения (данные представлены в виде медианы). В качестве контроля представлены клапаны без ИЭ. Для сравнения данных использовался тест Краскела – Уоллиса с поправкой на множественные сравнения

Fig. 3. Confocal microscopy imaging of native heart valves, a – 3-nitrotyrosine (red) and DAPI (blue) staining with the heart valve specimens marked by numerals: 1 – heart valve from infective endocarditis patient; 2, 3, 4 – control; b – quantitative analysis of images presented as median. The heart valves obtained from patients without infective endocarditis were used as control. Kruskal – Wallis test with correction on multiple was applied for data comparison

Samples under study

■ ИЭЛЕ

■ Контроль/Control

■ Контроль/Control

■ Контроль/Control

Несмотря на значительные успехи в области кардиологии и кардиохирургии, ежегодно количество дисфункций как нативных, так и биопротезов клапанов продолжает неуклонно расти. Стоит отметить, что на сегодняшний день значительное внимание уделяется изучению нарушений функций биопротезов клапанов сердца [9], в то же время механизмы дисфункции нативных клапанов не до конца изучены. Учитывая тяжесть заболевания и рост заболеваемости ИЭ особое значение приобретает изучение патофизиологических путей развития данного состояния. Одним из важнейших звеньев патогенеза ИЭ является повреждение эндотелия клапана сердца или пристеночного эндокарда, возникающее вследствие дегенеративных и воспалительных изменений. Повреждение эндотелиального слоя провоцирует каскад патологических процессов с участием про- и противоспалительных факторов. Кроме того, прогрессирует тканевая гипоксия, а также происходит нарушение в системе гемостаза [10]. Также отмечается роль окислительного стресса и хронического воспаления на начальных этапах развития клапанной патологии [11].

Полученные нами данные дополняют ранее опубликованную работу, посвященную роли сывороточных уровней молекул клеточной адгезии и эндотелина, а также полиморфных вариантов генов, кодирующих данные молекулы, в патогенез ИЭ [8]. В нашем исследовании мы установили, что уровень генной экспрессии молекул кле- точной адгезии, за исключением VCAM1, был одинаков в нативных створках независимо от патологии клапана сердца. Ранее показано, что при воздействии на эндотелий клапана сердца наблюдается усиление экспрессии молекул адгезии сосудистых клеток (VCAM1) и молекул внутриклеточной адгезии (ICAM1) [12]. Известным фактом является то, что сосудистый эндотелий подвержен действию различных факторов (свободные радикалы, воспалительные белки и др.), однако система синтеза оксида азота является важным звеном поддержания сосудистого тонуса. Так, в одной из отечественных работ отмечается, что наличие генотипа 4b/4b гена NOS3 уменьшает вероятность возникновения эндокардита как инфекционной, так и неинфекционной природы [5]. В нашем исследовании отмечается статистически значимый сниженный уровень генной экспрессии в нативных клапанах сердца, пораженных ИЭ, по сравнению с контрольными образцами клапанов.

Основная масса научных исследований молекулярных механизмов развития дисфункции клапанов посвящена изучению процессов воспаления. Группа ученых, используя метод иммуногистохимического окрашивания, показала, что во время активного воспалительного ответа в створках клапана содержится значительное количество IL-8 и TNFɑ [13]. Неоднократно показано, что ИЭ сопровождается местным и системным воспалением с увеличением концентраций следующих цитокинов: IL-6,

IL-2R и IL-1β [14, 15]. Кроме того, установлено, что цитокины наряду с продуктами бактериального происхождения способны усиливать продукцию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами и моноцитами путем активации НАДФН-оксидазы [16]. В одной из последних работ предложена гипотеза о том, что дисфункция клапанов сердца может быть связана с дефектом митохондрий, сопровождающимся увеличением супероксидных радикалов, являющихся предшественниками перекиси водорода.

В исследованиях отмечается, что высвобождение перекиси водорода в образцах миокарда пациентов с ИЭ в 2,14 раза выше по сравнению с образцами миокарда, полученными от пациентов с другой клапанной патологией [17].

В целом, в проведенном исследовании впервые показан профиль генной экспрессии маркеров окислительного стресса, а также молекул межклеточной адгезии, что может свидетельствовать о нарушении эндотелиального слоя клапанных структур.

Заключение

Створки нативных клапанов сердца, пораженных инфекционным эндокардитом, характеризуются сниженной экспрессией генов, вовлеченных в процессы окислительного стресса и генов, кодирующих молекулы клеточной адгезии.