Изменение каталитических характеристик алкогольдегидрогеназы при введении в ферментативную систему фармпрепаратов пирацетам, зорекс и унитиол

Введение. Известно, что алкоголъдегидрогеназа - фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды. Источниками алкогольдегидрогеназы служат ткани животных (например, печень лошади), грибы, дрожжи, бактерии; возможно нахождение фермента и в других источниках. Наиболее доступными, стабильными и активными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади (Авилова и др., 2001; Родионова, Сметанникова, 2006а, б).

В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты Пирацетам и Зорекс, но эффективность их применения определяется знанием молекулярно-кинетического механизма их действия на фермент АДГ, который не исследован (Лапина, Сметанникова, 2007; Лапина, Золотарева, 2009).

Целью настоящей работы явилось исследование изменения каталитических характеристик алкогольдегидрогеназы печени лошади при введении в ферментативную систему фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола.

Методика. В качестве возможного регулятора активности алкогольдегидрогеназы изучены фармпрепараты Пирацетам, Зорекс и Унитиол (Буров, Ведерникова, 1985). Для изучения каталитической реакции в спектрофотометрическую кювету помещали поочередно 0.1 мл одного из фармпрепаратов (0,5x10'2М, 1,5х10"2М, 2,5х 0'2М, 4,5x10" 2М, 5,5x10"2М); 0,1 мл раствора субстрата NAD (1,5х10"2М); 0,1 мл раствора субстрата этилового спирта (1,5 10'2М); 0,1 мл АДГ (2,4x10" 4М). Содержимое кюветы быстро перемешивали и определяли оптическую плотность (D) при длине волны 345 нм в течение 5 мин через каждые 15 с на спектрометре «Specol». Контрольная кювета не содержала субстрата (субстрат заменяли бидистиллированной водой).

Ферментативная реакция сопровождалась восстановлением НАД. При окислении спирта происходило восстановление НАД до НАД Н2 (на 1моль окисленного спирта образуется 1 моль НАД-Нг). Его количество определяли спектрофотометрически при Х=345нм. Конечным продуктом ферментативной реакции являлся уксусный альдегид (Кочетов, 1994; Лапина, Золотарева, 2008а).

Объект исследования — фермент алкогольдегидрогеназа печени лошади - коммерческий препарат («Reanal», Венгрия).

Активность рассчитывали исходя из данных изменения оптической плотности D во времени хода ферментативной реакции, после чего строились кинетические кривые (D - 1) (Лапина, Золотарева, 20086).

Результаты и обсуждение. В условиях оптимального соотношения концентраций всех компонентов реакционной среды, а именно, АДГ, этанола, НАД, Пирацетама, Зорекса и Унитиола, были рассчитаны ферментативные параметры (табл. 1).

Таблица 1 Значения каталитических характеристик АДГ при введении фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола

Ферментативные системы	Эффекторы	Молекулярная масса	Кт, 10"5М	Утах, 10"4 опт.ед./с	Тип активации
1	Контроль	—	2,51±0,17	3,51±0,17	—
3	Пирацетам	142,16	5,03±0,39	20,01±0,39	Па
4	Зорекс	630,09	2,03±0,17	6,62±0,17	1а
5	Унитиол	124,23	2,12±0,16	6,34±0,16	1а

Из табл. 1 видно, что Пирацетам в большей степени влияет на образование фермент-субстратного комплекса. Суммарный наблюдаемый эффект - ослабление взаимодействия фермента и субстрата при введении Пирацетама. Именно в этих условиях активность алкогольдегидрогеназы максимальна. Следовательно, при добавлении Пирацетама этанол с участием АДГ утилизируется наиболее эффективно.

Рассчитанные ферментативные параметры и соответственно типы активации фермента для фармпрепаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол в ферментативных системах имеют разнонаправленный характер изменений: в случае Пирацетама - тип активации Па, а в случае Зорекса и Унитиола - тип активации 1а. Это не позволяет провести сопоставление найденных значений ферментативных параметров АДГ, так как типы активации различны. Поэтому наряду с первым и вторым способами определения ферментативных параметров был применен ещё один способ анализа значений ферментативных параметров - метод векторного построения полученных экспериментальных данных в Км' V- системе координат.

На основе данных табл. 1 построили кривую течения -геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой АДГ печени лошади (рисунок).

Рисунок. Пространственная кривая АДГ-реакции в трехмерной Км' V - системе координат, активируемой фармпрепаратами Зорекс (3), Унитиол (1) и Пирацетам (2)

На основе рисунка рассчитали дополнительный ферментативный параметр - интенсивность активации (длины pl^^-, pld^v Р^^ауу векторов) для трех обсуждаемых ферментативных систем и сравнили этот параметр для изученных ферментативных систем (табл. 2).

Таблица 2

Значения длин P^(iy, pld^-, Р^^ -векторов

Препарат	Ферментативные системы	Длины Р - векторов, у. е.
Пирацетам	3	2,50
Зорекс	4	0,48
Унитиол	5	0,39

Вестник ТвГУ. Серия "Биология и экология". 2014. № 1

Именно этот интегральный параметр несет обобщенную количественную информацию об интенсивности активации фермента.

Самым действенным для АДГ среди изученных фармпрепаратов является Пирацетам (2,50 у. е.). Эффективность фармпрепаратов Зорекс и Унитиол в сравнении с Пирацетамом в 5,2 раз ниже. Кроме того, данные табл. 2 указывают на преобладающий вклад компонента Зорекса в сравнении с Унитиолом. Обращает на себя внимание то, что при введении в ферментативную систему изученных фармпрепаратов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) меняются не только тип активации, но и механизм изучаемой каталитической реакции, а также её интенсивность.

Заключение. Таким образом, впервые разработанный и апробированный многоэтапный научно-методический подход позволил детально изучить ферментативное поведение АДГ при добавлении Пирацетама, Зорекса и Унитиола и может служить основой для изучения других фармпрепаратов.

Лапина Т.П. Изменение каталитических характеристик алкогольдегидрогеназы при введении в ферментативную систему фармпрепаратов пирацетам, зорекс и унитол / Т.П. Лапина, Н.В. Парфентьева // Вести. ТвГУ. Сер. Биология и экология. 2014. № 1. С. 75-79.