Изменение молекулярно-массовых характеристик коллагена, выделенного из шкур рыб, при облучении СВЧ излучением

Коллаген – фибриллярный белок, имеющий уникальную правозакрученную трехспиральную структуру, является основным структурным белком человека. Он составляет треть общей массы белка в организме в качестве структурных единиц кожи, сосудов и мышц [1].

Множество современных приемопередающих устройств различного назначения работает в S-диапазоне частот (2–4 ГГц). В частности, одной из индустриальных частот является широко распространенная для разных приложений частота 2,4 ГГц (WiFi, DECT, Bluetooth и т. п.). С другой стороны, в настоящее время идет активное освоение терагерцового диапазона частот: такое излучение начинает внедряться в медицину в качестве терагерцовых томографов, с помощью которых можно исследовать кожу, сосуды, мышцы для выявления опухолей и т. п. [2]. В связи с этим важно знать пороговые значения, до которых можно использовать излучение различных диапазонов без вреда для организма, т. е. не вызывающее разрушения тканей, в частности коллагена. Поэтому актуальной задачей является изучение влияния излучения различных диапазонов на состояние коллагена. Особый интерес представляет терагерцовый диапазон.

Целью данной работы является выявление изменений молекулярно-массовых характеристик высокомолекулярного коллагена, свидетельствующее о его разрушении, под влиянием СВЧ из-лучения.В качестве модельного объекта выбран морской коллаген, имеющий большее структурное сходство с коллагеном человека. Главной задачей стал анализ коллагена методом ГПХ до и после облучения с различной частотой и энергией.

Экспериментальная часть

Образцы шкур рыб облучали электромагнитным излучением сразличными частотами. В качестве источников излучения использовался магнетрон с частотой 2,45 ГГц и автоматизированный терагерцовый комплекс на основе 263 ГГц гиротрона (фотография представлена на рисунке), созданного в ИПФ РАН (Нижний Новгород) [3].

Коллаген извлекали из образцов методом, описанным в работе [4]. Для выделенного коллагена определяли молекулярно-массовые параметры методом ГПХ. Пробоподготовку осуществляли путем фильтрования образцов с использованием насадочных мембран Millipore Millex-LCR (PTFE 0.45 m). Хроматографическое разделение проводили с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа фирмы SHIMADZU CTO-20A/20AC (Япония) с программным модулем LC-Solutions-GPC. Разделение проводили с применением колонки Tosoh Bioscience TSKgel

G3000SWxl с диаметром пор 5 мкм. В качестве детектора использовали низкотемпературный светорассеивающий детектор ELSD-LT II. Элюентом служил 0,5 М раствор уксусной кислоты. Скорость потока 0,8 мл/мин. Для калибровки применяли узкодисперсные образцы декстрана с диапазоном молекулярных масс 1000–410000 Да (Fluca).

Фотография 263 ГГц гиротрона в криомагните

Обсуждение результатов

Для достижения поставленной цели проводили облучение шкур рыб СВЧ излучением с частотами 2,45 и 263 ГГц так, что поглощенная энергия (доза облучения) составляла от 300 до 900 Дж. При облучении как с частотой 2,45 ГГц, так и 263 ГГц с увеличением дозы облучения наблюдались следующие закономерности: увеличение энергии до 400 Дж мало влияет на молекулярно-массовые характеристики коллагена, выделенного из шкуры рыб. Так в контрольном не-облученном образце (табл. 1, строка 1) содержание высокомолекулярного коллагена (ММ~250– 300 кДа) составляет ~70 % (~30 % приходится на параллельно образующийся при выделении коллагена из шкур рыб гидролизат с низкой ММ~15 кДа).

Таблица 1

Данные о соотношении фракций коллагена, выделенного из шкур рыб, после электромагнитного облучения с частотой 2,5 ГГц

Физическая химия

Аналогичный состав имеет место и для первых двух образцов в табл. 1, где представлены результаты исследований состава коллагена по значениям ММ после облучения с частотой 2,45 ГГц. При дальнейшем постепенном увеличении энергии до 850 Дж происходит равномерное уменьшение в образцах доли высокомолекулярного коллагена с 73 до 26 % и соответствующее увеличение низкомолекулярной фракции с 27 до 74 % ( табл. 1, столбцы 3 и 4, соответственно). Следует также обратить внимание на то, что разрушение исходных макромолекул происходит не путем постепенного уменьшения ММ исходного образца, а благодаря деструкции отдельных высокомолекулярных цепей до практически олигомерных фрагментов. Об этом свидетельствует незначительное изменение коэффициента полидисперсности (Мw/Мn) высокомолекулярной фракции в пределах 1,1–1,2.

При облучении с более высокой частотой – 263 ГГц наблюдаются следующие закономерности (табл. 2). В контрольном необлученном образце (табл. 2, строка 1) содержание высокомолекулярного коллагена (ММ~250–300 кДа) составляет ~86 %, ~11 % приходится на параллельно образующийся при выделении коллагена из шкур рыб гидролизат с ММ~15 кДа (фракция 1) и ~8 кДа (фракция 2)). При облучении с энергией 150, 200, 300 кДж состав коллагена практически не меняется (табл. 2, строки 2–4). При дальнейшем постепенном увеличении энергии до 450 Дж происходит равномерное уменьшение в образцах доли высокомолекулярного коллагена с 86 до 66 % и соответствующее увеличение низкомолекулярной фракции с ММ ~15 кДа с 11 до 39 % с неизменным содержанием фракции с ММ ~8 кДа в количестве 3 % (табл. 2, строки 2–6).

Таблица 2

Данные о соотношении фракций коллагена, выделенного из шкур рыб, после электромагнитного облучения с частотой 263 ГГц

При последующем увеличении поглощенной энергии происходит дальнейшее сокращение в образцах доли высокомолекулярного коллагена до 50 %, при этом наряду с двумя ранее обсужденными фракциями появляется коллаген с ММ ~75–80 кДа в заметных количествах 38–41 %. Как и в случае с облучением с частотой 2,45 ГГц разрушение исходных макромолекул происходит не путем постепенного разрушения с равномерным уменьшением ММ, а благодаря деструкции отдельных высокомолекулярных цепей до практически олигомерных фрагментов при облучении с мощностью до 450 кДж. Дальнейшее увеличение дозы облучения приводит к деструкции до фракций с ММ~15 кДа и с ММ ~75–80 кДа. Как и в случае облучения с частотой 2,45 ГГц изменение (М w/ М n высокомолекулярной фракции происходит незначительно в пределах 1,1–1,2.

Выводы

Таким образом, установлено, что при обработке шкур рыб электромагнитным излучением с частотой 2,45 ГГц при значении поглощенной энергии от 400 Дж, в образцах выделенного из них коллагена происходит уменьшение доли высокомолекулярного и возрастание доли одной фракции низкомолекулярного коллагена. При облучении с более высокой частотой – 263 ГГц – изменение состава фракций выделенного коллагена происходит также при величине поглощенной энергии выше 400 Дж, но при этом наблюдается деструкция высокомолекулярного коллагена с образованием двух новых фракций с различной молекулярной массой.