Изменение состояния нервной системы и показателей периферической крови на фоне интоксикации бензолом в эксперименте

Предприятия нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности с гигиенической точки зрения характеризуются наличием в воздухе рабочей зоны многочисленных потенциально опасных веществ, являющихся химическими факторами риска как для здоро- вья работников этих предприятий, так и для всего населения [12, 15].

Среди продукции нефтехимической промышленности наиболее широко применяемыми считаются бензин, ацетон и бензол. Самый токсичный из них – бензол [5, 10]. Это вещество

в больших концентрациях действует на центральную нервную систему (ЦНС) как наркотик, а при хроническом действии малых доз – становится ядом крови и кроветворных органов [13, 14, 17]. Также известно, что в зависимости от концентрации бензол, попадая в организм, может приводить к различным патологическим реакциям. Клинических проявлений при этом может не быть на протяжении длительного времени, но воздействие бензола на организм представляет значительную опасность в плане отдаленных последствий: развития лейкозов, генетических нарушений, истощения всего комплекса защитно-приспособительных реакций [12, 15].

На сегодняшний день установлена связь между лейкоцитарной реакцией и нейрогумо-ральными и эндокринными изменениями организма [9, 14]. Так, при возбуждении симпатической нервной системы увеличивается число лейкоцитов, эозинофилов и нейтрофилов, а при активности адаптивных гормонов коры надпочечников уменьшается количество эозинофилов на 50 % и более [4, 9]. Считается, что по величине отношения нейтрофилов к лимфоцитам можно судить об активности минералокортикоидов [9, 17].

Учитывая тесную взаимосвязь между состоянием нейроэндокринной системы и периферической кровью, определена цель работы – изучить состояние этих двух систем на фоне острой и хронической интоксикации бензолом.

Материалы и методы . Проведены острые и хронические эксперименты на двух видах лабораторных животных (белые мыши, кролики).

Острый эксперимент был поставлен на 45 безлинейных белых мышах, выращенных в виварии Научно-исследовательского центра Азербайджанского медицинского университета. Вес мышей – 18–22 г. Животные были разделены на две группы: 1-я – интактные животные, 2-я – подвергающиеся ингаляционной затравке бензолом в дозе 32,6 мг/л с повторяющимися промежутками в два дня.

Хронической затравке бензолом подвергались 72 кролика рода «шиншилла». Интоксикация проводилась ежедневно на протяжении 4 месяцев, по 4 часа, с одним свободным от затравки днем в неделю, с месячным восстановительным периодом после завершения затравки. Средняя затравочная концентрация бензола в камерах состояла в пределах 1240 ± 82 мг/м3. Животные были разделены на три группы: I группа подвергалась затравке повышающимися концентрациями бензола, II группа – колеблющимися (интермиттирующими) концентрациями, III группа – действию бензола не подвергалась (животные группы контроля).

В качестве затравочного материала использовался бензол ЧДА (чистый для анализа) (ГОСТ 5055-75)1. Концентрацию бензола в затравочных камерах проверяли регулярно путем анализа воздуха. Воздух в камерах беспрерывно перемешивался вентилятором.

Режим повышающихся концентраций создавался путем введения в камеру по 0,25 пороговой концентрации каждые 15 минут, учитывая, что порог вредного действия бензола составляет 2000 мг/м3 [13].

При режиме колеблющихся концентраций бензол в камеру подавался через 30 мин в таком количестве, чтобы концентрации резко колебались. В отдельные периоды камера открывалась для проветривания на 20 минут. При этом последовательность концентраций каждого дня менялась на протяжении 12 дней (табл. 1), а затем повторялась в таком же порядке в течение 4 месяцев.

Таблица 1

Режим затравки животных колеблющимися (интермиттирующими) концентрациями бензола

День затравки	Концентрации бензола в камере, в долях от пороговой
1-й	0,25	2,0	0	5,25	0,5	0	6,0	0	2,0
2-й	5,0	0	1,75	0	4,0	0,25	0	4,5	0,5
3-й	4,5	0,25	0	3,75	0	0,5	0	1,5	5,5
4-й	2,0	0	4,5	0	2,5	0	5,0	0,25	1,75
5-й	1,75	0,25	0	4,75	0	1,25	0	6,0	2,0
6-й	1,25	6,0	0	0,25	0	5,5	0	2,0	1,0
7-й	0,25	0	2,5	0	4,75	1,5	0	3,75	3,25
8-й	0,5	1,25	0	5,75	0	2,5	0	1,5	4,5
9-й	4,75	0	1,25	0	4,5	0	1,5	2,25	1,75
10-й	2,0	0,25	0	6,75	0	4,0	0	0,5	2,5
11-й	4,0	0	0,25	0	5,75	0,5	1,5	0	4,0
12-й	0,25	4,75	1,0	0	3,75	0	1,25	0	5,0

Кровь для исследования брали утром до кормления из краевой вены уха кроликов и хвостовой вены мышей. Число ретикулоцитов подсчитывали в препаратах, крашенных бриллиантовым крезиловым синим методом Паппенгейма.

Для камерного подсчета эозинофилов кровь разводили жидкостью, предложенной И.С. Пирала-швили [11], камерный подсчет базофилов производили по модификации М.П. Вильчинского [2].

Исследованы также скорость оседания эритроцитов, кислотоустойчивость эритроцитов. Кислотная стойкость эритроцитов определялась по методу И.А. Терскова и И.И. Гитель-зона в модификации А.И. Воробьева [2]; ацетилхолин (АХ) – по методу С. Хестрина [16], холинэстеразы (ХЭ) – по методу Э.Ш. Матлина [7]. Был применен триоксииндоловый флуори-метрический метод определения адреналина (А), норадреналина (НА), дофамина (ДА) и диоксифенилаланина (ДОФА) в одной порции мочи [13]. Для выяснения состояния свертывающей системы крови определялось время свертывания крови (ВСК), ретракция кровяного сгустка (РКС), время рекальцификации плазмы (ВРП), толерантность плазмы к гепарину (ТПГ), протромбиновое время и протромбиновый индекс, концентрация фибриногена, фибринолитическая активность крови (ФА) [1, 6].

Вне опытов все животные по содержанию и питанию находились в одинаковых условиях. Все эксперименты на животных проводились согласно «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г.)2.

Установление статистически значимых различий между сравниваемыми группами проводилось с использованием параметрического критерия Стьюдента. Выявление причинноследственных связей между факторами воздействия и эффектом осуществлялось применением многофакторных корреляционных анализов и других методов математической статистики.

Результаты и их обсуждение. Данные острых экспериментов показали, что однократное действие бензола оказывает на ЦНС наркотический эффект, характеризующийся фазами возбуждения и торможения. Причем повторная экспозиция бензолом сопровождается сокращением времени пребывания животных в наркотическом состоянии. Например, при 5-кратном воздействии на животных бензолом время сокращается от 34,60 ± 3,05 мин до 12,27 ± 3,71 мин, что оценивается как наступление адаптации животных к действию бензола [9, 10].

Таблица 2

Картина элементов лейкоформулы при однократном и повторном воздействии бензола (в % от фона, взятого за 100)

Показатель	Режим действия вещества
	однократное действие	повторное действие
Лейкоциты	73,70	86,70
Эозинофилы	41,20	60,0
Нейтрофилы	87,60	98,30
Лимфоциты	62,80	86,30
Нейтрофилы/лимфоциты (Н/Л)	139,50	81,10

Из материалов табл. 2, отражающих изменения картины крови при разных режимах воздействия бензола, видно, что после выхода животных из наркотического состояния происходит достоверное снижение количества лейкоцитов и их специфических форм. Значительное уменьшение количества лимфоцитов способствует возрастанию градиента «нейтро-фил/лейкоцит» (Н/Л) до 139,50 % от фонового показателя.

При повторном действии токсиканта произошли изменения состояния компонентов крови, отличающиеся от исходного состояния показателей до первой затравки. Эти изменения выразились в увеличении числа лейкоцитов при снижении градиента Н/Л. Абсолютное число эозинофилов вернулось к исходному числу до первой затравки (см. табл. 2).

При хроническом воздействии интермиттирующими и возрастающими концентрациями бензола со стороны морфологической картины периферической крови животных (кроликов) наблюдалось значительное снижение количества эритроцитов (рис. 1) и гемоглобина, более значимо проявляющихся на 1-м месяце хронической затравки интермиттирующими концентрациями.

К концу наблюдаемого периода происходила некоторая нормализация состава красной крови, о чем свидетельствует приближенное к фоновому показателю и контрольному уровню количество эритроцитов (у подопытных животных – (9,20 ± 0,30)⋅1012/л, у контрольных животных – (10,40 ± 0,15)⋅1012/л, фоновый уровень – (11,30 ± 0,40)⋅1012/л).

1012/л 12

Фон

Период исследования

1-й месяц 2-й месяц 3-й месяц 4-й месяц

—*— Повышающиеся концентрации —е— Интермиттирующие концентрации

Рис. 1. Динамика изменения количества эритроцитов в периферической крови у животных при разных режимах воздействия малых концентраций бензола (показатели достоверны по сравнению с контролем, р < 0,01)

Рис. 2. Динамика изменения общей скорости оседания эритроцитов периферической крови животных при хронической ингаляционной затравке бензолом (показатели достоверны по сравнению с контролем, р < 0,05)

У этой группы животных установлено также увеличение скорости оседания эритроцитов, более выраженно проявляющееся к концу 4-го месяца хронического действия бензола (рис. 2).

Наряду с некоторыми количественными изменениями, исследования показали ряд качественных сдвигов в картине красной крови, о чем свидетельствуют изменения кислото-устойчивости эритроцитов, выражающиеся в отклонении кислотных эритрограмм вправо. Появление этих изменений в конце 2-го месяца воздействия бензола указывает на образование в периферической крови молодых, более устойчивых к воздействию кислой среды эритроцитов.

Как видно из табл. 3, месячная экспозиция бензолом животных привела к снижению эозинофильно-базофильного градиента на 61,80 % за счет резкого повышения числа базофилов (187,70 %, р < 0,01) при малозначимом повышении числа эозинофилов (107,70 %, р < 0,05).

Таблица 3

Динамика показателей свертывающей системы крови и эозинофильно-базофильной ассоциации

Показатель	Срок исследования и величина показателя (в % от исходного уровня)
	1-й месяц	2-й месяц	3-й месяц	4-й месяц
Эозинофилы/базофилы	61,80	110,20	100,0	112,40
Ретракция кровяного сгустка	123,1*	128,4*	140,4*	140,0*
Время свертывания крови	112,70	125,50*	144,50*	147,50*
Время рекальцификации плазмы	109,30	101,20	107,60	106,70
Протромбиновое время	04,50	94,0	97,80*	94,0
Протромбиновый индекс	94,10	102,30	99,30	101,20
Толерантность плазмы к гепарину	115,40	97,60	145,9*	178,8*

П р и м е ч а н и е: * – показатели, достоверно отличные от контроля ( р < 0,02).

Указанные изменения сопровождались, главным образом, повышением показателя ретракции кровяного сгустка (123,1 %, р < 0,02). Также наблюдалась тенденция к удлинению времени свертывания крови (112,7 %, р < 0,02) и рекальцификации плазмы (109,3 %, р < 0,02).

В последующие месяцы эксперимента постепенно возрастало время свертывания крови (125,50–147,50 %, р < 0,001), ретракция кровяного сгустка (128,4–140,0 %, р < 0,01) и только через три месяца повысилась толерантность плазмы к гепарину (145,9–178,8 %, р < 0,02) (см. табл. 3). Эти данные свидетельствуют о постепенном увеличении антикоагуляционных свойств крови. Вместе с тем на фоне отмеченных изменений в свертывающей системе крови нами не наблюдалось специфического для бензола кровотечения, чему соответствуют данные об отсутствии эозинофильно-базофильной диссоциации. Последнее объясняется увеличением числа эозинофилов .

Под влиянием повышающихся концентраций бензола максимальное отклонение количества лейкоцитов от исходных значений наступило на 2-м месяце воздействия в сторону повышения: от 9,95 до 13,08⋅103 мкл (рис. 4). К концу 4-го месяца затравки у этой группы животных количество лейкоцитов снизилось до 5,95 ± 0,49⋅103 мкл.

Восстановление показателей до исходного уровня в течение месяца после прекращения затравки животных свидетельствует об обратимости наступивших изменений.

Сдвиги в лейкоцитарной формуле животных второй группы носили более выраженный характер. Так, волнообразные изменения содержания лейкоцитов и их специфических элементов при воздействии бензола в режиме интермиттирующей концентрации сопровождалось увеличением числа лейкоцитов на 1-м месяце затравки (от 10,13 до 13,94⋅103 мкл). К концу периода наблюдений выявлено существенное снижение количества лейкоцитов у подопытных кроликов (5,30⋅103 мкл). Следует отметить, что статистически достоверный (по сравнению с исходным уровнем) низкий уровень количества лейкоцитов в конце месячного восстановительного периода (исходный уровень – 10,13 ± 0,60⋅103 мкл, уровень в восстановительном периоде – 6,18 ± 0,73⋅103 мкл) может свидетельствовать о значительном снижении реактивности организма животных при воздействии интермиттирующей концентрации бензола.

Изменения в показателях лейкоцитарной формулы появились в конце 1-го месяца затравки. Эти изменения характеризовались увеличением количества нейтрофилов (нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево), а также лимфоцитозом и моноцитозом. К концу затравочного периода сдвиги в лейкоцитарной формуле у подопытных животных имели противоположную направленность: отмечались абсолютная нейтропения, лимфоцитопения и моноцитопения. Через один месяц после прекращения контакта животных с бензолом полного восстановления показателей (возвращение к исходным величинам) не произошло, что может свидетельствовать либо о недостаточном восстановительном периоде, либо о значительном снижении реактивности организма.

Таким образом, изучение состояния лейкоцитарной реакции подопытных животных на действие бензола в разных режимах интоксикации показало, что режим колеблющейся концентрации бензола оказывает более выраженное действие по сравнению с действием режима возрастающей концентрации токсиканта. Так, достоверное снижение уровня лейкоцитов, соответствующее 3-м и 4-м месяцам затравки при обоих режимах интоксикации животных,

103 мкл

Исх. уровень 1-й месяц 2-й месяц 3-й месяц 4-й месяц Восст. период

—*— Повышающиеся концентрации

—е— Интермиттирующие концентрации

△ Контроль

Рис. 3. Динамика изменений лейкоцитов в периферической крови животных, подвергавшихся хронической затравке бензолом (показатели достоверны по сравнению с контролем, р < 0,01)

не нормализовалось в месячном восстановительном периоде у животных, находящихся в условиях интермиттирующей концентрации бензола. Следовательно, колеблющиеся в течение затравочного периода концентрации вещества вызывали более значимые изменения в организме животных, что приводило к истощению адаптационных механизмов.

Полученные нами данные экспериментальных исследований были проанализированы по обмену катехоламинов, системы ацетилхолин – холинэстераза. Установлено, что реактивные изменения симпатоадреналовой системы характеризуются определенным, неоднозначным в различные сроки действия интермиттирующих концентраций бензола уровнем активности процессов биосинтеза, секреции, элиминации и метаболизма катехоламинов. Первая стадия реакции возникла на 1-м месяце опыта и характеризовалась синхронной активацией симпатоадреналовой системы (САС), когда увеличивалась экскреция адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА с мочой (рис. 4). Причем на этой стадии у подопытных кроликов более существенно увеличивалась активность симпатической нервной системы, так как количество НА – основного медиатора симпатической нервной системы, возрастало несколько больше, что вызывало относительное снижение отношения А/НА.

К концу периода экспозиции отмечалась вторая стадия реакции, которую можно обозначить как фазу диссоциации секреторно- симпатической активности. При этом выявлено дальнейшее повышение концентрации НА, некоторое относительное снижение уровня А, дофамина и ДОФА в моче.

После первоначального повышения резервных возможностей САС и увеличения уровня предшественников в моче во второй стадии наблюдаются признаки истощения эндогенного резерва катехоламинов – ДОФА (рис. 4).

Одновременно с активацией симпатической нервной системы определялась и активация сопряженной с ней парасимпатической нервной системы, что выражалось в увеличении содержания ацетилхолина в крови, повышении активности ацетилхолинэстеразы и снижении бутирил-холинэстеразы. К концу периода наблюдений активность бутирилхолинэстеразы снизилась, а уровень АХ оставался высоким (табл. 4).

Рис. 4. Содержание катехоламинов и их предшественников в суточной моче у кроликов при хронической затравке интермиттирующими концентрациями бензола (А – адреналин, НА – норадреналин, ДА – дофамин, ДОФА – диоксифенилаланин)

Таблица 4

Содержание ацетилхолина и активность холинэстеразы у кроликов при воздействии малых концентраций бензол

Группа животных и режим затравки	Период исследования, мес.	Исследуемые показатели и их величины
		АХ, мкг %	ИХ, мкг/мин	ЛХ, мкг/мин
I. Повышающиеся концентрации	Исходный уровень (фон)	0,20 ± 0,02	0,89 ± 0,05	0,29 ± 0,05
	Через 1	0,33 ± 0,04	0,66 ± 0,06	0,38 ± 0,10
	Через 2	0,46 ± 0,03	0,92 ± 0,03	0,32 ± 0,02
	Через 3	0,49 ± 0,03	0,98 ± 0,04	0,20 ± 0,01
	Через 4	0,40 ± 0,02	0,99 ± 0,08	0,19 ± 0,01
II. Интермиттирующие концентрации	Исходный уровень (фон)	0,22 ± 0,03	0,94 ± 0,14	0,28 ± 0,04
	Через 1	0,34 ± 0,05	0,69 ± 0,09	0,44 ± 0,12
	Через 2	0,50 ± 0,06	1,14 ± 0,04	0,32 ± 0,02
	Через 3	0,51 ± 0,04	1,26 ± 0,08	0,21 ± 0,01
	Через 4	0,46 ± 0,04	1,08 ± 0,12	0,18 ± 0,01
Контроль	Исходный уровень (фон)	0,21 ± 0,01	0,87 ± 0,07	0,27 ± 0,03
	Через 1	0,22 ± 0,02	0,89 ± 0,08	0,26 ± 0,03
	Через 2	0,20 ± 0,02	0,93 ± 0,03	0,27 ± 0,03
	Через 3	0,22 ± 0,02	0,90 ± 0,04	0,26 ± 0,04
	Через 4	0,21 ± 0,02	0,87 ± 0,04	0,25 ± 0,03

Результаты наших исследований и работы других ученых [8, 12, 13, 17] показывают, что первичная реакция организма на токсическое действие бензола проявляется со стороны системы периферической крови, которая в свою очередь дает информацию о состоянии симпатической нервной системы. Следовательно, первичная реакция организма на эндогенное раздражение выражается в возбуждении симпатической нервной системы с соответствующим повышением симпатической активности крови. Первичное усиление симпатической активности крови является «пусковым» моментом для компенсаторной реакции парасимпатической нервной системы и других корригирующих систем [9, 15].

Выводы. Таким образом, действие бензола в малых концентрациях вызывало перестройку ряда регулирующих систем в организме подопытных животных. Причем наиболее выраженные и ранние сдвиги определялись со стороны белой крови и катехоламинов (адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА). Выявление признаков истощения эндогенного резерва катехоламинов – ДОФА, а также эозинофильно-базофильная диссоциация являются прогностически неблагоприятным признаком, так как именно в эти сроки (на 4-м месяце затравок) появляются уже существенные изменения в крови – лейкопения, нейтропения, лимфо-и моноцитопения. При этом режим колеблющейся концентрации бензола оказывает более выраженное токсическое действие по сравнению с действием режима возрастающей концентрации токсиканта. В восстановительном периоде у животных, находящихся в условиях интермиттирующей концентрации бензола, сниженный на 3-м и 4-м месяце уровень лейкоцитов не доходил до нормальных значений.