Изменения концентрации показателей антикоагулянтной системы в крови беременных с полиморфизмом в генах фолатного цикла

Беременность в организме женщины ассоциирована с большими перестройками в её организме: формируется маточноплацентарный круг кровообращения, что ведет к повышению коагуляционного потенциала; возрастание гиперкоагуляционного потенциала, как приспособления к препятствию чрезмерной кровопотери при предстоящих родах. Однако эти изменения могут привести к риску развития тромботических состояний, образованию тромбов и ускорению свертывания крови. А значит, может привести не только к угрозе прерывания беременности, но и несет опасность для здоровья будущей матери [1; 2]. Для предотвращения чрезмерного свёртывания крови в организме присутствует антикоагулянтная система. Однако, в присутствии полиморфизма генов фолатного цикла в ДНК человека, возможно снижение анти- коагуляционного потенциала крови [3-6]. При большой важности этой системы, изучений изменения её показателей при наличии вариаций в генах фолатного цикла на сегодняшний день недостаточно.

Цель исследования : определить изменения концентрации показателей антикоа-гулянтой системы в плазме беременных при наличии полиморфизма генов фолат-ного цикла.

Объект исследования: плазма крови.

Предмет исследования: изменения концентрации показателей антикоагулянтной системы в плазме крови у беременных женщин с полиморфизмом генов фолатно-го цикла.

Материал и методы .

Материалом исследования служила плазма 498 женщин на разных сроках беременности (I триместр (до 12 недель), II триместр (с 13 по 27 неделю) и III триместр (с 28 недели до момента родов) с гомо- и гетерозиготным формами полиморфизма фолатного цикла, которые составили три экспериментальные группы. В три группы контроля вошли плазмы 183 практически здоровых беременных женщин на разных сроках беременности.

В работе исследовали показатели антикоагулянтной системы крови - антитромбин III, протеин С и протеин S [7-9]. Определение концентрации протеина С и антитромбина III в плазме крови осуществ- лялись с помощью хромогенного метода, а концентрацию протеина S - клоттинговым методом [9]. Измерения показателей в плазме крови осуществлялись с использованием оригинальных реактивов Хемосил. Для определения полиморфизма в генах фолатного цикла использовался метод ПЦР real time с детекцией кривых плавления.

Результаты исследования. В таблице 1 представлено распределение полиморфизма генов фолатного цикла с учётом гомо- и гетерозиготных форм.

Таблица 1. Распределение полиморфизма

Гомозигота/ гетерозигота	Экспериментальные группы, n = 498			Контрольные группы, n = 183
	MTHFR, n	MTRR, n	MTR, n	183
Гомозигота	89	80	15
Гетерозигота	134	105	75

Немаловажный фактор определения в нарушении факторов свертывания крови играет распределение и распространенность полиморфных вариантов генов фо-латного цикла среди беременных. Согласно данным таблицы 1, наиболее распространённой оказалась гетерозиготная форма полиморфизма гена MTHFR, что соотносится с данными А.В. Марковского, в работе которого, также отмечалась высокая встречаемость данного генотипа полиморфизма [6], реже встречался полиморфизм гена MTR в гомозиготной форме при обследовании беременных.

Изменения концентрации показателей антикоагулянтной системы крови экспериментальных и контрольных групп представлены в таблице.

Таблица 2. Концентрация антикоагулянтов в плазме беременных экспериментальных и контрольной групп ____________________________________________________________

Фактор	Гомозигот/ гетерозигота	Триместр	Группы
			Экспериментальные группы (мутации), концентрация, %			Контрольные группы, концентрация, %
			MTHFR	MTRR	MTR
АТ III	Гомозигота	I	93,2 * + 5,6	93,1 * +11,3	97,0+3,0	99,2 * ** +11,7 (К1)
		II	88,2**410,7	94,3 * ## +11,3	110,0 #а ±10,7	103,2 * ** +10,3 (К2)
		III	94,0 ** +12,1	98,7+12,8	102,6+15,2	106,2 * ** +11,0 (К3)
	Гетерозигота	I	92,2 ** А ° +12,7	97,3 **а +9,7	85,4 °*#а +13,0	99,2 * ** +11,7 (К1)
		II	100,5 ##° +12,5	101,8 ##а +13,6	96,8 °**## +11,6	103,2 * ** +10,3 (К2)
		III	94,4 ** +20,9	104+15,8	101,5 ° +14,5	106,2 * ** +11,0 (К3)
ПРС	Гомозигота	I	104,5 ° +11,3	116+38,8	-	114,3+22,6 (К1)
		II	116,8+22,6	116,8+36,8	-	111,0+18,1 (К2)
		III	131 ** ° +19,7	116+21,7	-	101,0 ** +31,8 (К3)
	Гетерозигота	I	102+30,5	105,5+22,7	105,0+22,4	114,3+22,6 (К1)
		II	117,4+17,0	115,0+19,9	112,4+21,7	111,0+18,1 (К2)
		III	119,0+28,2	117,0+32,9	134,0 ** +29,6	101 ** +31,8 (К3)
H?S	Гомозигота	I	61,6 а +28,2	67,6 # +12,1	-	76,2 * +20,2 (К1)
		II	48,5 ** +12,2	44,75 ** +9,0	-	62,1+14,0 (К2)
		III	39,7+8,9	36,5 **а +10,0	-	47,1+10,0 (К3)
	Гетерозигота	I	63,4 ** +13,2	65,2 а# +22,6	54,5 * °+15,2	76,2 * ** +20,2 (К1)
		II	48,3 ** +18,3	46,1 * ±14,1	49,2+21,9	62,1 * ** +14,0 (К2)
		III	39,5 **а± 9,1	39,1 а# ±8,0	41,1 ° ±1,9	47,1 * +10,0 (К3)

• * – р ⩽ 0,01 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальной группы и соответствующей контрольной группе; ** – р ⩽ 0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальной группы и соответствующей контрольной группе;

• # – р ⩽ 0,01 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в пределах нарушения в одном гене; ## – р ⩽ 0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в пределах нарушения в одном гене;

^– р ⩽ 0,01 ‒ в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в разных генах;

º – р ⩽ 0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальных групп с одинаковыми полиморфизмами в пределах нарушения в одном гене.

Наглядно изменение концентрации антитромбина III в крови беременных с полиморфизмом фолатного цикла представлено на рисунке 1.

110=

is контроль MTHFR гомо MTHFR гетеро MTRR гомо s MIRR гетеро ^ MTR гомо MTR гетеро

Примечания

• * – р⩽0,01 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальной группы и соответствующей контрольной группе; ** – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальной группы и соответствующей контрольной группе;

• # – р⩽0,01 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в пределах нарушения в одном гене; ## – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в пределах нарушения в одном гене;

• º – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальных групп с одинаковыми полиморфизмами в пределах нарушения в одном гене.

Рис. 1. Изменение концентрации антитромбина III у беременных при полиморфизме генов фолатного цикла

У беременных с гомозиготной формой полиморфизма гена MTHFR отмечалась низкая концентрация антитромбина III в плазме (рис. 1) во втором триместре беременности. Содержание в плазме крови антикоагулянта было снижено в 1,17 раза относительно показателей антитромбина III в плазме крови группы контроля и составило 88,2%+10,7% (р⩽0,05). Также на протяжении остальных этапов беременности показатели плазмы крови были снижены относительно показателей группы кон- троля: так, в первом триместре – в 1,06 раза и составили 93,2%+5,6% (р⩽0,01), в третьем – в 1,13 раза – 94%+12,1%, соответственно (р⩽0,05). В своей работе Е. А. Трифонова и другие соавторы отмечали, что наличие гомозиготного варианта полиморфизма данного гена является наиболее значимым фактором развития возможных тромботических осложнений [3].

При гетерозиготной форме полиморфизма исследуемого гена MTHFR отмечали (рис. 1), что в период второго тримест- ра беременности у экспериментальной группы с данным генотипом, наоборот, возрастала концентрация антитромбина III в плазме крови, увеличиваясь в сравнении с показателями первого триместра в 1,10 раза (р⩽0,05), но ниже в 1,03 раза относительно показателей плазмы контрольной группы и составила 100,5% +12,5%. Таким образом, во втором периоде беременности наблюдалась разница в 1,14 раза между содержанием антикоагулянта в плазме крови меду гомо- и гетерозиготной формами полиморфизма (р⩽0,05). В третьем триместре беременности концентрация антикоагулянта в плазме крови беременных была равной показателю характерному для гомозиготной формы мутации, со снижением относительно значения группы сравнения в 1,13 раза и составила 94,4%+20,9% (р<0,05). Согласно исследованию Т.П. Бондарь и А.Ю. Муратовой такие изменения концентрации антитромбина III возможны при наличии мутации в гене MTHFR, что способствует развитию тром-бофилических состояний в совокупности с нарастанием гиперкоагуляционного потенциала крови [10].

При гомозиготном генотипе полиморфизма MTRR в плазме крови беременных женщин (рис. 1) концентрация антитромбина III в плазме крови оставалась сниженной относительно показателей группы контроля. Значительные отклонения отмечались в плазме крови беременных, находящихся на втором триместре беременности (94,3%+11,3%). При проявлении гетерозиготной формы полиморфизма гена MTRR концентрация антитромбина III в плазме крови на всех этапах беременности не отличалась от показателей группы кон- троля и составила: в первом триместре 97,3%+9,7%, во втором ‒ 101,8%+13,6% и в третьем триместре беременности концентрация антитромбина III была равна 104%+15,8%.

При рассмотрении изменений концентрации антитромбина III в плазме беременных, содержащей гомозиготную форму полиморфизма гена MTR, отмечалось повышение содержания антикоагулянта в плазме крови с учётом роста срока беременности, причём отмечалось значительное повышение концентрации антитромбина III в 1,07 раза в крови беременных во втором триместре относительно показателей группы контроля (110,0%+10,7%).

При гетерозиготном генотипе полиморфизма MTR нами отмечалось постепенное повышение содержания антикоагулянта в плазме крови беременных (рис. 1): в плазме крови беременных в первом триместре отмечалась разница в показателях в 1,16 раза при сравнении с показателями группы контроля и концентрация антитромбина III в плазме крови составляла 85,4%+13,0% (р<0,01); в плазме крови во втором триместре беременности разница между гомо- и гетерозиготными генотипами составила 1,14 раза, (р⩽0,05). Во втором и третьем триместрах беременности отмечались равные изменения концентрации исследуемого вещества в плазме крови (в 1,06 раза относительно показателей контрольной группы и на втором триместре она составляла 96,8%+11,6% (р<0,05) и 101,5%+14,5%).

Изменение концентрации протеина С во время беременности при наличии полиморфизма фолатного цикла отражено на рисунке 2.

Примечание

** – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальных групп и соответствующей контрольной группы;

º – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальных групп и одинаковыми полиморфизмами в пределах нарушения в одном гене.

Рис. 2. Изменения концентрации протеина С у беременных при полиморфизме генов

фолатного цикла

Концентрации протеина С в плазме крови беременных с полиморфизмом гена MTHFR на протяжении всей беременности возрастала по мере увеличения срока гестации (рис. 2). Повышение концентрации антикоагулянта в плазме крови отмечалась в 1,05 раза относительно показателей плазмы контрольной группы во втором триместре беременности и в плазме крови беременных (гомозиготная форма мутации) составляла 116,8%+22,6%, а в плазме, содержащей гетерозиготную форму ‒ 117,4%+17,0%. В третьем триместре беременности концентрация протеина С в плазме крови беременных (гомозиготная форма полиморфизма гена MTHFR) отличалась в 1,30 раза в сравнении с показателями группы контроля и была равна 131%+19,7% (р⩽0,05), а в крови (гетерозиготная форма) отмечалось повышение активности в 1,18 раза, которое составило 119%+28,2%. Наличие в генах мутаций, затрагивающих программирование MTHFR, способствует развитию гиперго-моцистеинемии, которая осуществляет возрастание коагуляционного процесса за счёт активации протеина С и ингибирова- ния-блокировки АТ III в плазме. Помимо этих нарушений возникает торможение фибринолиза, что в совокупности ведет к риску нарушения процесса протекания беременности [5].

Концентрация протеина С (рис. 2) в плазме крови беременных, содержащая гомозиготную форму полиморфизма гена MTRR, не изменялась на всех этапах беременности и составила 106%. Однако, в первом триместре в плазме крови пациенток с гомозиготным генотипом отмечалось значительное повышение концентрации протеина С в плазме крови, в плазме беременных с гетерозиготной формой мутации отмечалось понижение концентрации в 1,08 раза относительно показателей группы контроля (105,5% + 22,7%). Т.Ю. Пест-рикова и соавт. отмечали, что состояние гипергомоцистеинемии на развитие которого влияют нарушения генов фолатного цикла способны активировать систему протеина С [5].

Концентрация протеина С в плазме крови беременных, имеющих гетерозиготный генотип MTR в плазме крови в первом триместре была 1,09 раза ниже, в сравне- нии с концентрацией в плазме крови контрольной группы и составляла 105%+22,4%, во втором триместре концентрация протеина С была равна 112,4%+21,7% в третьем триместре бере- менности – 134%+29,6% (р⩽0,05).

Изменение концентрации протеина S во время беременности при наличии полиморфизма фолатного цикла отражено на рисунке 3.

Примечание

* – р⩽0,01 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальной группы и соответствующей контрольной группе; ** – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальной группы и соответствующей контрольной группе;

# – р⩽0,01 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в пределах нарушения в одном гене; ## – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в пределах нарушения в одном гене;

^– р⩽0,01 ‒ в экспериментальных группах с учетом вариантов полиморфизма в разных генах;

º – р⩽0,05 ‒ значимость различий между показателями плазмы крови экспериментальных групп с одинаковыми полиморфизмами в пределах нарушения в одном гене.

Рис. 3. Изменение концентрации протеина S у беременных при полиморфизме генов фо- латного цикла

Концентрация протеина S в плазме крови беременных женщин, с отягощением в виде полиморфизма генов фолатного цикла (рис. 3), значительно снижалась в 1,28 раза плазме беременных с полиморфизмом в гене MTHFR во втором триместре беременности, составив в плазме гомозиготной формы 48,5% + 12,2% и гетерозиготной – 48,3% + 18,3%, соответственно. В третьем триместре отмечалось последующее уменьшение в 1,19 раза, что составило у гомозиготной формы 39,7% + 8,9% и у гетерозиготной – 39,5% + 9,1% (р⩽0,05).

При выявленном полиморфизме гена MTRR концентрация протеина S (рис. 3) в плазме крови снижалась на протяжении беременности, а к концу третьего триместра вышла за пределы референтных значений: при гомозиготном полиморфизме составила 36,5%+10,0%, при гетерозиготном полиморфизме – 39,1%+8,0%.

При наличии гетерозиготного полиморфизма MTR в плазме крови беременных (рис.3) выраженное в 1,4 раза уменьшение концентрации протеина S в плазме крови наблюдалось в первом триместре беременности и составило 54,5% + 15,2% (р⩽0,01).

Таким образом, полиморфизм генов фо-латного цикла оказывает влияние на показатели системы гемостаза беременных:

• -    концентрация антитромбина III повышалась по мере увеличения срока гестации, кроме показателей в группе женщин с гетерозиготной формой полиморфизма гена MTHFR; в плазме крови остальных групп концентрация антитромбина III оказывалась ниже, за исключением гетерозиготного генотипа гена MTR во втором триместре (110,0%+10,7%);

  - концентрация протеина С в плазме крови беременных экспериментальных

групп возрастала с учетом увеличения недель беременности, наиболее значитель- ное изменение содержания антикоагулянта было отмечено в плазме крови группы с гетерозиготным генотипом полиморфизма гена MTR на третьем триместре беременности (134%+29,6%);

• -    концентрация протеина S в плазме крови женщин экспериментальных групп

снижалась относительно показателей плазмы крови женщин, входящих в кон- трольную группу; значительные изменения были отмечены в плазме крови бере- менных всех экспериментальных групп с гомозиготной формой полиморфизма гена MTRR (61,6%+28,2%; 48,5%+12,2%; 39,7%+8,9%) и в плазме крови беременных с гетерозиготным генотипом полиморфизма гена MTR в первом триместре (54,5%+15,2%).