Изменения спектра производных фибринопептида в плазме крови при действии о-изобутил-s-(2-диэтиламиноэтил) метилтиофосфоната

В настоящее время уничтожение химического оружия в соответствии с федеральной целевой программой "Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации" является одной из приоритетных технологических задач. Однако существует опасность для персонала, участвующего в выполнении работ, которая может быть связана как с однократным острым поражением в аварийных ситуациях, так и с хроническим отравлением малыми дозами отравляющих веществ (ОВ) [1]. Доказательством поражения ОВ может служить изменение биохимической активности определенных ферментов, так называемых биомаркеров интоксикации. Так, известными биомаркерами острой и подострой интоксикации организма фосфорорганическими соединениями (ФОС) являются ферменты ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БХЭ), активность которых снижается. Из перечня ФОС наиболее токсичным считается О-изобутил-S-(2-диэтил-аминоэтил)метилтиофосфонат — российский VХ (RVX). Как и другие ФОС, RVX обладает цитотоксическим действием на клетки нервной системы, печени, системы крови, а также вызывает неблагоприятные эффекты при длительном воздействии субтоксических концентраций [2]. Однако диагностика при действии малых доз ФОС вообще и RVX в частности затруднена отсутствием подавления активности АХЭ или БХЭ.

В последние годы активно развивается область протеомики, которая получила название пептидо-мика [3–5]. Это направление достаточно перспективно при поиске биомаркеров различных патологических состояний, в том числе и при интоксикации. Воздействие ОВ на организм приводит к появлению нехарактерных для здорового состояния соединений, которые могут быть детектированы тем или иным способом. К таким соединениям в первую очередь относятся белки и пептиды крови. Набор низкомолекулярных пептидов можно рассматривать как "молекулярный отпечаток" состояния биологических систем, или "роспись" (signature). Состояние пептидного спектра ("пептидом", "деградом") отражает состояние определенных белков-ферментов, активность или сам факт существования которых чрезвычайно сложно измерить прямыми биохимическими методами [6, 7]. С точки зрения специфичности и чувствительности наиболее удобным методом для анализа пептидов является масс-спектрометрия (МS), а применительно к массовому анализу наиболее подходящим методом представляется масс-спектрометрия с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MALDI).

Целью данной работы было изучение пептидного спектра низкомолекулярной фракции плазмы крови крыс при интоксикации RVX, а также пептидного спектра плазмы крови человека при взаимодействии с RVX in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Субхроническую интоксикацию крыс обеспечивали добавлением RVX в питьевую воду животных в течение трех недель, из расчета ежедневного потребления вещества в дозе 1/100 ЛД50. Низкомолекулярную фракцию пептидов плазмы крови крыс получали путем осаждения белков плазмы ацетонитрилом с 2 % уксусной кислоты в соотношении 1 : 2 в течение 30 мин при 4 °С с последующим центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин. Затем осадок перерастворяли в 0.1 % растворе трифторуксусной кислоты (ТФУ), а не-растворившуюся фракцию из неосажденных на предыдущей стадии белков удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Пробу обессоливали с помощью мембраны с привитой фазой С-18, помещенной в микроколонку, после чего пептиды, которые связались с мембраной, смывали на мишень 60 %-м раствором ацетонитрила в 0.1 %-м ТФУ, содержащим а-циано-4-гидрокси-коричную кислоту в концентрации 10 мг/мл.

Цельную венозную кровь от здоровых доноров отбирали в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА (Becton Dickinson). Цельную кровь инкубировали с RVX в конечной концентрации 0.1 мг/мл при 37 °С в течение 1 часа. Затем кровь центрифугировали при 1000 g 10 мин. Низкомолекулярную фракцию пептидов плазмы крови человека получали путем осаждения белков плазмы ацетонитрилом с 2 % уксусной кислоты в соотношении 1 : 2 в течение 30 мин при 4°С и последующим центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин.

Масс-спектрометрический анализ пептидов проводили на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) с источником MALDI, оснащенном УФ-лазером (337 нм) в режиме детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона при следующих настройках ионного источника. Напряжение на IS1 — 25 кВ, IS2 — 21.75 кВ, напряжение на линзах (Lens) 9.5 кВ, напряжения на рефлектроне (Ref) — 26.99 и 13.80 кВ (Ref 2). Ионы детектировали в диапазоне m / z от 700 до 2000.

Рис. 1. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови контрольных крыс (а) и крыс после субхронической интоксикации RVX (б)

Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF-TOF проводили при помощи программного обеспечения Flex Analysis 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). К спектрам применяли сглаживание по алгоритму Savizky Golay (ширина 0.1 m / z , 1 цикл), и вычитание базовой линии согласно алгоритму Convex Hull. Использовали следующие параметры детекции пиков: алгоритм детекции пиков SNAP; соотношение сигнал/шум 2; порог качества спектра 100). Поиск в базе SwisProt осуществляли с помощью программного комплекса MASCOT (Matrix Science, Великобритания). Точная моноизотопная масса и форма изотопного распределения вычислялись при помощи программы MassPro (ИАнП РАН). Данные MS-MS анализа представлялись с помощью программы Sequence Viewer 2.0 (ИАнП РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основной целью данной работы было выявление и идентификация пептидных маркеров влияния RVX на низкомолекулярную фракцию плазмы крови крыс и человека. На первом этапе проводился масс-спектрометрический анализ проб, по- лученных от крыс, подвергнутых воздействию RVX in vivo, и контрольных проб из плазмы крови здоровых крыс. При сравнении спектров значительного различия между пептидными пулами по качественному составу в диапазоне масс 700– 2000 Да не было обнаружено. Но ряд сигналов, не выделяющихся по интенсивности из общего пула в спектрах контрольной группы, становятся мажорными в спектрах образцов экспериментальной группы (рис. 1, б). Кроме того, в этих спектрах появляется сигнал с MH+ 1452.77 Да, который отсутствует в контроле. Для каждого из пептидов, которым соответствуют указанные сигналы, был проведен MS-MS анализ, результат которого показал, что все они относятся к фибринопептиду А, который является частью фибриногена, и характеризуются потерей одной аминокислоты с N-конца (рис. 2, б). На рис. 3 приведен фрагментный спектр пептида с MH+ 1452.77 Да с указанием b- и y-фрагментных серий. Как показано на рисунке, данный спектр принадлежит пептиду с аминокислотной последовательностью GTTSEFIDEGAGIR, являющемуся частью фибринопептида А ADTGTTSEFIDEGAGIR с потерей трех аминокислот с N-конца.

1266 646

1060.482

1.0

б

TSEFIEAGGDIR

1294.665

'TSEFIEAGGDIR

1395.686

1553.764

а

1324.761

TSEFIEAGGDIR

1294.675

1688.764

EFIEAGGDIR

1106.623

TGTTSEFIEAGGDIR

GTTSEFIEAGGDIR

1452.722

1584.879

1193.612

TGTTSEFIE-

1553.712

DTGTTSEFIEAGGDIR

1211.630

FIEAGGDIR

1387.731 1514.797

1161.622

977.366

^i.QVi

|----1 α ul^laJj^JUd^

1668.880175998g

1000 1100  1200   1300

1L. m / z

1870.949

1782.961 |

1830.975

ADTGTTSEFIEAGGDIR

1739.809

DTGTTSEFIEAGGDIR

SEFIEAGGDIR

1193.632

1000   1100 1200

SEFIEAGGDIR

FIEAGGDIR

977.552

1300   1400   1500

1600  1700

1901.837

1830.805

EFIEAGGDIR 1106.554

TTSEFIEAGGDIR

1395.647

α

.1V.vWJaWWW

1450 1460

1800    m / z

Рис. 2. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови контрольных крыс (а) и крыс после субхронической интоксикации RVX (б). Показано отсутствие пептида с MH⁺ 1452.77 Да в плазме крови контрольных животных (а)

а

3000-

ы

Ь2

ЬЗ Ь4

у4

Ь5

уб

Ь7

Ь8

980.220

Ь9 .

2000-

У1

у2 уЗ

У5

у7

у8

У У

187.0311

2(8

: 58, )36

ЫО Ы1 yll

| Ы2 уЮ

ЫЗ

у12

1 DOO-

^129^

159.02

е

У13

452.678

110.012

595. )90

577.1 .4

73 i

977.471

1106.539

б

Ш             73 >106   s wk wЦ itwkw, м р.w^w

110Е

t , к ^W

лЖ pwgTTj ,

1395.92.3

100   200    300    400   500   600   700    800    900   1000 1100 1200 1300 1400 1500

О 100   200    300    400   500   600   700    800    900   1000 1100 1200 1300 1400 1500

Mass/Charge

Рис. 3. Масс-спектр пептида GTTSEFIDEGAGIR с MH⁺ 1452.77 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией (а), и определение его последовательности (б)

Рис. 4. Масс-спектры пептидной фракции плазмы крови человека (а) и плазмы крови человека после инкубации с RVX in vitro (б)

Таким образом, в низкомолекулярной фракции плазмы крови крыс, подвергнутых субхронической интоксикации RVX, обнаружен пептид фибриногеновой природы; этот факт наряду с характерным изменением пептидного спектра в целом может служить молекулярным свидетельством интоксикации RVX.

В следующем эксперименте мы добавляли RVX в кровь человека in vitro (см. раздел "Материалы и методы"), после чего исследовали пептидную фракцию плазмы крови. Как и в эксперименте с крысами in vivo, некоторые компоненты спектра становятся мажорными (рис. 4, б). Более того, все мажорные сигналы в процессе идентификации были отнесены к фибринопептиду А, лишенного аминокислот с N-конца. Масс-спектрометрический анализ образцов контрольной плазмы и плазмы с добавлением RVX показал определенное сходство полученных результатов с теми, что были получены в эксперименте in vivo с кровью крыс. В образцах появляется пептид GEGDFLAEGGGVR, MH+ 1263.6 Да, также имеющий фибриногеновую природу и характеризующийся отсутствием трех аминокислот по сравнению с фибринопептидом человека (ADSGEGDFLAEGGGVR). MS-MS спектр пептида GEGDFLAEGGGVR приводится на рис. 5.

Таким образом, в обоих экспериментах обнаружен фрагмент фибринопептида, отсутствующий в контрольных пробах и имеющий разницу с родительским пептидом в три аминокислоты, отщепленные с N-конца. Фрагменты фибринопептидов крысы и человека начинаются с глицина с N-конца, а предшествующая отщепленная аминокислота является нейтральной и имеет гидроксильную группу (треонин в фибринопептиде крысы и серин в фибринопептиде человека) (см. таблицу).

Рис. 5. Масс-спектр (а) пептида GEGDFLAEGGGVR MH⁺ 1263.6 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией, и определение его последовательности (б)

Пептиды, относящиеся к фибринопептиду А, выявленные в плазме крови крысы и человека, в контроле и при действии RVX

№ п/п	Крыса			Человек
	Пептид (MH + Да)	Контроль	VX	Пептид (MH + Да)	Контроль	VX
1	ADTGTTSEFIDEGAGIR + Phospho ST	–	–	ADSGEGDFLAEGGGVR + Phospho ST (1616.6515)	–	+
2	ADTGTTSEFIDEGAGIR (1739.809)	+	+	ADSGEGDFLAEGGGVR (1536.6912)	+	+
3	DTGTTSEFIDEGAGIR (1668.772)	+	+	DSGEGDFLAEGGGVR (1465.6481)	+	+
4	TGTTSEFIDEGAGIR (1553.745)	+	+	SGEGDFLAEGGGVR (1350.6212)	+	+
5	GTTSEFIDEGAGIR (1452.697)	–	+	GEGDFLAEGGGVR (1263.5891)	–	+
6	TTSEFIDEGAGIR (1395.676)	+	+	EGDFLAEGGGVR (1206.5677)	+	+
7	TSEFIDEGAGIR (1294.628)	+	+	GDFLAEGGGVR (1077.5251)	+	+
8	SEFIDEGAGIR (1193.580)	+	+	DFLAEGGGVR (1020.5036)	+	+
9	EFIDEGAGIR (1106.548)	+	+	FLAEGGGVR (905.4767)	+	+

По-видимому, при действии RVX происходит ингибирование ряда экзопептидаз (N-аминопептидаз), в результате чего изменяется количественное соотношение компонентов низкомолекулярной фракции плазмы крови, в частности наблюдается значительное усиление сигналов фиб-ринопептидных фрагментов по отношению к остальным сигналам в спектре, а также появляются другие пептиды, имеющие фибриногеновую природу. С другой стороны, возможно ингибирование антитромбина, что приводит к усиленному расщеплению фибриногена и повышению уровня фиб-ринопептида А. Так, помимо вышеназванного пептида с MH+ 1263.6 Да в пробах плазмы человека с добавлением RVX появляется еще один пептид c MH+ 1616.6 Да. По результатам анализа методом тандемной масс-спектрометрии, данный сигнал был также отнесен к фибринопептиду А, фосфорилированному по серину (рис. 6). Фибри-нопептид А — это пептид, отщепляемый тромбином от фибриногена при активации системы свертывания крови. Тромбин гидролизует 4 пептидные связи Arg–Gly в фибриногене, в результате чего образуются фибринопептиды А и В [8]. Функциональное значение отщепленных фибринопептидов и их фрагментов остается неясным.

Таким образом, на основе полученных результатов можно сделать следующие выводы.

• •    Основной пептидный фон в плазме крови человека и крысы после воздействия RVX составляют пептиды, принадлежащие к фибриногену, в частности к фибринопептиду А.

• •    Пептиды, входящие в состав низкомолекулярной фракции сыворотки крови (GTTSEFIDEGAGIR) и (GEGDFLAEGGGVR) соответственно крысы и человека, могут появляться в результате инактивации экзопептидаз при воздействии RVX [7].

• •    Два пептида, имеющие фибриногеновую природу в сыворотке крови человека, а именно ADSGEGDFLAEGGGVR + Phospho (ST) и GEGDFLAEGGGVR, могут свидетельствовать о воздействии RVX на организм, в частности на систему гуморального гемостаза.

  

  О 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

  Mass/Charge

  Рис. 6. Масс-спектр (а) пептида ADSGEGDFLAEGGGVR , фосфорилированного по серину с MH⁺ 1616.6 Да, полученный тандемной масс-спектрометрией, и определение его последовательности (б)