Изменения спектров флуоресценции цервикальной ткани при некоторых патологиях

Неинвазивные спектральные методы исследования играют все большую роль в диагностике ряда болезней, и со временем, несомненно, займут лидирующие позиции среди всех методов диагностики. Одним из таких методов, причем наиболее эффективным, является использование флуоресценции в ультрафиолетовом диапазоне для анализа состояния ткани. Но для реализации возможностей такого метода необходимо изучить влияние тех или иных морфологических изменений, происходящих в патологических биотканях, на их спектральные свойства.

В данной работе представлены результаты исследования влияния основных эндогенных флуорофоров на спектр флуоресценции цервикальной ткани в норме и при некоторых патологиях: эктопия, лейкоплаксия 1. Исследования проводились путем математического моделирования спектров флуоресценции основных эндогенных флуорофоров: NAD, FAD, коллагена.

Расчет спектров флуоресценции основных эндогенных флуорофоров

В сложной молекуле переходы, связанные с изменением вращательных состояний, трудно выделить, и поэтому с хорошей степенью точности можно говорить лишь об электронно-колебательных переходах.

Для расчета электронного спектра многоатомной молекулы в данной работе используется один из неэмпирических методов, а именно метод самосогласованного поля Хартри-Фока (МО ЛКАО). Этот метод реализо-

ван в комплексе сервисных программ HyperChem Release 7.5.

Пользователем задается только структурная формула молекулы. Результат расчета электронного спектра появляется в виде наборов линий (переходов) в диалоговом окне программы. Например, электронный спектр молекулы NAD представлен на рисунке 1.

Каждая колебательная компонента представляется в виде гауссовой кривой. Полуширины в данном подходе являются эмпирическими параметрами, задаются одинаковыми для всех компонент и выбираются из лучшего согласия рассчитанного спектра поглощения с экспериментальным спектром. Такой выбор полуширины никоим образом не носит характера подгонки теоретического спектра к эксперименту в широком спектральном диапазоне. Традиционный квантовомеханический расчет электронного спектра играет в этом случае роль первого приближения 2. Применение данного метода дало удовлетворительные результаты, показав тем самым его высокую работоспособность 3.

Спектр поглощения NAD представлен на рисунке 2. Полуширина каждой колебательной компоненты была выбрана равной 100 нм.

Спектр флуоресценции получают с помощью универсального соотношения Б.И. Степанова коллаген – белок 4. Молекула белка – биополимер, в котором мономерные единицы – аминокислотные остатки.

Спектр поглощения коллагена – это сумма спектров поглощения аминокислотных остатков с учетом числа каждого остатка в молекуле. Молекулу коллагена образуют бо-

длина волны, нм

Рис. 1. Электронный спектр молекулы NAD

лее 900 остатков 5. Как известно, разорванные связи вносят лишние уровни в валентную зону. Предполагается, что разорванные связи аминокислотных остатков заполнены псевдоатомами водорода. Очевидно, что введение псевдоатомов эквивалентно насыщению электронами лишних энергетических уровней молекулы.

Расчет спектра флуоресценции молекулы коллагена включал несколько этапов.

На первом этапе рассчитывали электронные спектры аминокислотных остатков белка неэмпирическим методом.

На втором этапе рассчитывали электронно-колебательные спектры аминокислотных остатков белка. Предполагается, что полуширина каждой колебательной компоненты равна 100 нм.

На третьем этапе рассчитывали спектр поглощения молекулы коллагена как сумму спектров поглощения аминокислотных остатков с учетом числа каждого в молекуле.

На четвертом этапе рассчитывали спектр флуоресценции с помощью универсального соотношения Б.И. Степанова.

Спектр флуоресценции молекулы коллагена представлен на рисунке 3.

Нормированные спектры основных эндогенных флуорофоров в рабочем диапазоне длин волн 350–600 нм представлены на рисунке 4.

Рис. 2. Спектр поглощения молекулы NAD

Модель расчета вкладов эндогенных флуорофоров

В эпителии содержатся молекулы NAD и FAD. Мышечный слой образован коллагеновыми волокнами и пронизан сосудами капиллярной сети.

Простая модель флуоресценции цервикальной ткани представлена на рисунке 5.

Предполагается, что интенсивность флуоресценции цервикальной ткани определяется закономерностью вида

Интенсивность флуоресценции эпителия определяется так:

• I— , (^ f ) = N' F U , ) + l « M (b, ). (2)

Интенсивность флуоресценции мышечного слоя определяется так:

• 1—    слоя (\ ) = « J ' ^k ^, >•    ( ³ )

3.5 2.5 0.5

где используется такое обозначение

k(X_f ) = K(X_f ) • exp {-[ m(X_e ) + m(X_f )] • d }.(4)

f эпителия f мышечного слоя f .

1.5

50           150          250           350          450

длина волны, нм

Рис. 3. Спектр флуоресценции коллагена

коллаген, гемоглобин

Рис. 5. Модель флуоресценции цервикальной ткани

Здесь λ_е – длина волны возбуждающего излучения; λ_f – длина волны флуоресценции; I ( λ_f ) – интенсивность флуоресценции в относительных единицах; F ( λ_f ), N ( λ_f ), К ( λ_f ) – нормированные спектры флуоресценции молекул FAD, NAD и коллагена соответственно; d – толщина мышечного слоя в мм; m ( λ_e ) и m ( λ_f ) – коэффициенты поглощения гемоглобина в мм^–1.

В данной работе с целью проведения количественного анализа осуществляется разложение спектров флуоресценции цервикальной ткани на спектры флуоресценции флуорофоров.

Из (1)–(4) следует, что интенсивность флуоресценции цервикальной ткани определяется закономерностью вида

I(X f ) = I R 0 | • F ( X f ) + I R , | • N(X f ) +

+ I R 2 I • k ( X f ).                   ⁽⁵⁾

Учитывается ослабление возбуждающего излучения ( X e = 350 нм) и излучения флуоресценции мышечного слоя вследствие поглощения гемоглобином. Предполагается, что флуоресценция вышележащих слоев не поглощается гемоглобином.

Предполагается, что F ( X _f ), N ( X _f ), k ( X _f ) -известные линейно независимые функции, а | R ₀|, | R ₁|, | R ₂| – неизвестные положительные коэффициенты.

Задача заключается в определении неизвестных постоянных |R0|, |R1|, |R2|. Искомые величины не могут быть измерены прибором непосредственно. Найти неизвестные постоянные позволяет метод наименьших квадра- тов. Ограничением на применимость метода является линейная зависимость I от |R0|, |R1|, IR2|, при этом зависимость от Xf может быть нелинейной. С учетом этого, экспериментальный спектр аппроксимируется выражением вида (5). Величина I измеряется абсолютно точно, и каждое измерение дает одну точку на плоскости (Xf I), принадлежащую кривой (5). Тогда достаточно проделать 3 измерения при различных значениях Xf (например, при 430, 450 и 470 нм). Подставляя результаты измерений в (5), получим систему линейных уравнений для |R0|, |R1|, |R2|, решая которую мы определим коэффициенты |R0|, |R1|, |R2| абсолютно точно.

Достаточное совпадение теоретического спектра с экспериментом 6 дает основания для утверждения, что исследуемая модель является приемлемой.

Модель реализована в виде электронного документа, подготовленного в программе MathCad.

Результаты

Результаты разложения экспериментальных спектров флуоресценции цервикальной ткани шейки матки на спектры флуорофоров представлены на рисунках 6–14. Результаты расчета вкладов флуорофоров представлены на соответствующих диаграммах.

Результаты для спектра первой пациентки в норме приведены на рисунке 6.

Результаты для спектра второй пациентки в норме приведены на рисунке 7.

биоткань(опыт)

FAD

NAD коллаген боткань(расчёт)

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.9

0.8

0.7

0.6

400      450      500

550      600

длина волны, нм

Рис. 6. Количественный контурный анализ спектра первой пациентки в норме

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

боткань(о пыт ) FAD

NAD колла ген би от кань (расчёт)

дли на в олны , нм

Рис. 7. Количественный контурный анализ спектра второй пациентки в норме

Результаты обработки спектра третьей пациентки в норме представлены на рисунке 8.

Результаты обработки спектра первой пациентки при эктопии представлены на рисунке 9.

длина волны, нм

Рис. 8. Количественный контурный анализ спектра третьей пациентки в норме

Рис. 9. Количественный контурный анализ спектра первой пациентки при эктопии

Результаты обработки спектра второй пациентки при эктопии представлены на рисунке 10.

Результаты обработки спектра третьей пациентки при эктопии представлены на рисунке 11.

Рис. 10. Количественный контурный анализ спектра второй пациентки при эктопии

длина волны, нм

Рис. 11. Количественный контурный анализ спектра третьей пациентки при эктопии

Результаты обработки спектра первой пациентки при лейкоплакии представлены на рисунке 12.

Результаты обработки спектра второй пациентки при лейкоплакии представлены на рисунке 13.

Результаты обработки спектра третьей пациентки при лейкоплакии представлены на рисунке 14.

Средние значения вкладов основных эндогенных флуорофоров и их среднеквадратичные отклонения представлены в таблице.

s

CD

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

биоткань(расчёт)

биоткань(опыт) FAD

—*— NAD

длина волны, нм

Рис. 12. Количественный контурный анализ спектра первой пациентки при лейкоплакии

Рис. 13. Количественный контурный анализ спектра второй пациентки при лейкоплакии

Рис. 14. Количественный контурный анализ спектра третьей пациентки при лейкоплакии

Таблица

Средние значения вкладов флуорофоров в зависимости от состояния цервикальной ткани

Выводы

Состояние ткани	Вклад FAD ± SD, %	Вклад NAD ± SD, %	Вклад коллагена ± SD, %
Норма	18 ± 0,57	28 ± 1,73	54 ± 2,08
Эктопия	13,33 ± 0,33	24,33 ± 2,02	62,33 ± 1,76
Лейкоплакия	30,66 ± 0,33	41,66 ± 0,33	27,66 ± 0,33