Изучение антигенности, иммуногенности и протективности ДНК-конструкций, содержащих фрагменты генов CP204L, E183l и EP402R вируса африканской чумы свиней

Африканская чума свиней (АЧС, ASF) — вирусная контагиозная септическая болезнь, поражающая диких и домашних свиней всех пород и возрастов. У домашних свиней и диких европейских кабанов отмечают сверхострое или острое течение заболевания с лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и смертностью до 100 %. В эндемичных регионах (некоторые страны Восточной Африки) отмечают подострую форму со смертностью от 30 до 70 %, а также хроническую — с очень низкой

^∗ Работа выполнена в рамках проекта РНФ «Создание кандидатной вакцины против африканской чумы свиней на основе химерных вирусов» (проект ¹ 16-16-00090).

смертностью (1-3). Исследования по разработке живых, инактивированных, субъединичных вакцин пока не принесли желаемых результатов (4-6). Определенные надежды возлагаются на конструирование рекомбинантных ДНК-вакцин (7, 8).

Вероятно, формирование специфической защиты при АЧС обеспечивается набором белков, которые индуцируют иммунологическую защиту, которую обеспечивают как цитотоксические Т-лимфоциты, так и антителозависимая клеточная цитотоксичность (9-11). На основании данных о локализации, структуре и функциональных свойствах вирусных белков, по-липептидной специфичности антител в сыворотке крови свиней после введения аттенуированных или вирулентных штаммов вируса АЧС (ASFV), последствиях иммунизации свиней выделенными из зараженных клеток или рекомбинантными белками в качестве потенциально протективных рассматривают белки р30, р54 и CD2v. Белки р30 и р54 функционально важны для прикрепления ASFV к клетке-мишени. Антитела к р54 блокируют связывание вириона с макрофагом, тогда как антитела к р30 ингибируют проникновение вириона в клетку. Белок CD2v обусловливает гемад-сорбирующие свойства вируса (12-14).

Изучение иммуногенных и протективных свойств ДНК-конструкций, содержащих гены вирусных белков р30, р54 и CD2v, подтвердили важную роль клеточного иммунитета в формировании специфической защиты от АЧС, что открывает перспективы для разработки препаратов нового поколения (15-17).

Ранее мы сообщали о получении рекомбинантных плазмид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v. Расчетные молекулярные массы немодифицированных рекомбинантных белков составили 21,6 кДа (rр30), 18,7 кДа (rр54) и 28,6 кДа (rCD2v). По реузльтатам иммуноблоттинга, в перевиваемой культуре клеток HEK-293T молекулярная масса антигенно активных продуктов трансляции pCI-neo/ASFV/p30 составила 21,6 кДа, pCI-neo/ASFV/p54 — 20,9 кДа и 36,3 кДа (18). По данным P. Gуmez-Puertas с соавт. (19) и F. Rodriguez с соавт. (20), масса мономера полноразмерного р54 — 24-28 кДа. В клетках HEK-293T, трансфи-цированнных pCI-neo/ASFV/CD2v, транслированные вирусоспецифические полипептиды имели молекулярные массы 28,8; 39,8; 63,1 и 104,7 кДа. Первый из них по размеру соответствовал расчетной немодифицирован-ной молекуле rCD2v. Остальные, по-видимому, представляли собой формы, в разной степени модифицированные в процессе гликозилирования и тримминга. Эти результаты в основном соответствуют данным L.C. Goa-tley и L.K. Dixon (21), которые в клетках Vero, трансфицированных плазмидой SV5CD2vHA, идентифицировали полипептиды рекомбинантного CD2v с молекулярными массами 26; 63; 89 и 104 кДа.

В представляемой работе мы иммунизировали животных А-клетками аутологичной культуры ЛС, трансфицированными in vitro рекомбинантными плазмидами, для повышения эффективности индукции противокле-точных механизмов защиты от АЧС, однако, как оказалось, при этом не удалось достигнуть протективности.

Цель нашего исследования — определить антигенность, иммуногенность и протективность продуктов трансляции рекомбинантных плазмид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v.

Методика. Домашних свиней породы крупная белая массой 20-25 кг получали из сектора подготовки подопытных животных ФГБНУ ФИЦВиМ. Использовали перевиваемую клеточную линию НЕК-293Т (Human Embryonic Kidney 293) из музея культур клеток ФГБНУ ФИЦВиМ и полученную 861

первичную культуру лейкоцитов крови свиньи. Вирулентный штамм ASFV Мозамбик-78 (М-78) и его аттенуированный дериват — штамм МК-200 были взяты из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ (22).

Для приготовления культуры ЛС у каждого животного брали кровь (30-40 см³) из краниальной полой вены, для стабилизации крови использовали гепарин (20 ед/см³). Кровь выдерживали 50-60 мин при температуре 37 ° С и собирали верхнюю фракцию, состоящую из плазмы и лейкоцитов. Ее центрифугировали при 2000 g 15 мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали до получения посевного материала лейкоцитов (4 млн/см³) в среде Игла МЕМ с 10 % гомологичной инактивированной (30 мин при 56 ° С) сыворотки крови, пенициллином (100-200 ЕД/см³) и стрептомицином (100-200 мг/см³). Клетки культивировали в 6-луночных планшетах в CO 2 -инкубаторе при 37 ° С. За 1 ч до постановки трансфекции 2-суточную культуру клеток ЛС переводили на бессывороточную среду.

Трансфекцию клеток ДНК-конструкциями проводили в течение 6-8 ч с применением Lipofectamine® («Thermo Fisher Scientific», США) по стандартному протоколу. Затем заменяли среду культивирования на среду Игла МЕМ с 10 % гомологичной свиной сыворотки и инкубировали 2-3 сут.

Анти-ASFV положительные сыворотки получали по следующей схеме: домашним свиньям внутримышечно вводили ASFV штамм МК-200, в дозе 6,5 lg ГАЕ50 (0-е сут). На 17-е сут этих свиней заражали внутримышечно штаммом ASFV М-78 в дозе 103 ГАЕ50. В периоды проявления клинических признаков заболевания (гипертермия, отказ от корма, геморрагии на ушах и брюхе) больных животных лечили введением внутримышечно ежедневно по 100 мг/кг фосфонуксусной кислоты до восстановления нормальной температуры тела (3-5 сут). Тотальное обескровливание свиней проводили на 38-е сут после начала эксперимента.

Получение меченных изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) иммуноглобулинов из сывороток иммунных к АЧС свиней (анти-ASFV FITC-иммуноглобулинов) и постановку реакции прямой иммунофлуоресценции осуществляли по ГОСТ 28573-90 «Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы». Результаты учитывали при люминесцентной микроскопии на флуоресцентном микроскопе Eclipse E200 («Nikon Corp.», Япония). Сыворотки крови свиней исследовали на наличие антител к белкам ASFV методами непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) и иммуноблоттинга (23, 24).

Результаты. В работе использовали полученные нами ранее экспрессирующие ДНК-конструкции (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v) с фрагментами генов CP204L , E183L , EP402R ASFV штамма МК-200 III сероиммунотипа (18).

Антигенную активность рекомбинантных белков, продуцируемых этими ДНК-конструкциями, изучали в культурах клеток HEK-293T и ЛС. Покровные стекла с трансфицированными клетками отбирали ежедневно и методом прямой иммунофлуоресценции определяли продукцию антигенно активных рекомбинантных белков. Максимум экспрессии в клетках HEK-293T и ЛС, трансфицированных pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v, наблюдали на 2-3-и сут (рис. 1).

Особенность схемы иммунизации свиней состояла в том, что ее проводили на 0-е, 14-е, 28-е сут с использованием А-клеток аутологичной культуры ЛС, трансфицированных in vitro используемыми рекомбинантными плазмидами. Предполагалось, что иммунизация антигенпредставляющи-862

А

Б

Рис. 1. Динамика синтеза антигенно активных продуктов трансляции в клетках перевиваемой линии НЕК-293Т (А) и первичной культуры лейкоцитов свиньи (Б) , трансфицированных рекомбинантной плазмидой pCI-neo/ASFV/p30 : а, б, в, г — соответственно 0, 1, 2, 3 сут после трансфекции (люминесцентная микроскопия, Eclipse E200, «Nikon Corp.», Япония, увеличение ½100).

ми клетками (макрофагами) обеспечит эффективную индукцию противо-клеточных механизмов защиты против АЧС. Для этого за 4 сут до иммуни-

зации от свиней ¹¹ 1-4 получали по 90 см3 культуры клеток ЛС. На 2-е сут культивирования в них вносили по 90 мкг pCI-neo/ASFV/p30 (¹ 1), pCI-neo/ASFV/p54 (¹ 2) или pCI-neo/ASFV/CD2v (¹ 3). От свиньи ¹ 4 90 см3 культуры ЛС делили на три части по 30 см3 и трансфицировали каждую одной из трех конструкций (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v), внося по 30 мкг плазмидной ДНК. Через 2 сут культуральные среды с не прикрепившимися клетками ЛС сливали, а монослой трансфицированных (около 107 А-клеток) механически снимали с подложки, отмывали при 2000 g 10 мин, ресуспендировали в 3 см3 фос- фатного буферного раствора (рН 7,2) и вводили в центральную ушную вену соответствующим аутологичным свиньям. За животными вели клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела. Методами непрямого ТФ ИФА и иммуноблоттинга мы не обнаружили в крови иммунизированных свиней антител к белкам ASFV на 0-е, 14-е, 28-е и 42-е сут. После контрольного заражения на 42-е сут штаммом М-78 ASFV в область шеи в дозе 102 ГАЕ50 четыре иммунизированные свиньи пали через 68 сут, а не иммунизированная (контрольная) — через 13 сут (рис. 2).

Рис. 2. Динамика температуры тела у свиней, иммунизированных разными рекомбинантными белками ASFV (1-4) , в период от заражения до гибели и у контрольного животного (5) после экспериментального заражения вирулентным штаммом ASFV Мозамбик-78: 1 — р30, 2 — р54, 3 — CD2v, 4 — р30, р54 и CD2v.

Свинья, которую иммунизировали А-клет-ками ЛС, трансфицированными конструкцией pCI-neo/ASFV/p30 (¹ 1), пала через 6 сут без клинических признаков и при отсутствии патологоанатомических проявлений. У остальных иммунизированных животных наблюдали повышение температуры тела, гибель на 7-8-е сут, а также характерные для АЧС патологоанатомиче- ские признаки (25). Заболевание у контрольного животного (¹ 5) характеризовалось потерей аппетита с одновременным угнетением и повышением температуры тела до 41,2-41,3 °С, парезами и параличами задних конечностей. Отмечали выраженный цианоз кожных покровов в области ушей, брюха, конечностей и промежности. Патологоанатомическая картина была характерна для АЧС.

Существенным недостатком кандидатных ДНК-вакцин считается относительно низкая индукция иммунных реакций, особенно у крупных млекопитающих. Для преодоления этой проблемы применительно к АЧС испытано несколько подходов: нацеливание (таргетинг), убиквитинирова-ние, иммунизация библиотеками экспрессии и вирусы BacMam (26). Первые попытки индуцировать защитный иммунный ответ против ASFV с использованием ДНК-конструкции, кодирующей два вирусных белка — p54 и p30 в виде химерного протеина (PQ), оказались неудачными. ДНК-конструкции, кодирующие только PQ, обеспечивали высокую продукцию антител у иммунизированных мышей, но не у свиней (8).

Иммунизация ДНК-конструкцией рСМV-sHAPQ, дополненной геном белка CD2v (НА), индуцировала у свиней гуморальный иммунный ответ, однако особи не были защищены от контрольного заражения, показывая клинические признаки АЧС и кинетику виремии, неотличимые от таковых у контрольных животных. Для того чтобы избежать нежелательной индукции антител и усилить специфические CD8+-Т-клеточные ответы, была разработана конструкция рСМV-UbsHAPQ, кодирующая антигенные детерминанты p30, p54 и CD2v, слитые с клеточным убиквитином (Ubs). Двукратная иммунизация рСМV-UbsHAPQ не индуцировала гуморальный ответ у свиней, но обеспечивала частичную защиту против контрольного заражения ASFV, подтверждая важность T-клеточного ответа в защите от этого вируса. Четырехкратная иммунизация рСМV-UbsHAPQ стимулировала образование антител к р30 и р54, что приводило, по-видимому, к снижению протективного эффекта CD8+-Т-клеток (16). Не исключено, что более ранняя (по сравнению с контрольным животным) гибель иммунизированных свиней в нашем опыте обусловлена индукцией вирусоспецифических антител в титрах, недостаточных для обнаружения методами непрямого ТФ ИФА и иммуноблоттинга.

Таким образом, методом иммунофлуоресценции доказана экспрессия ASFV-специфических продуктов трансляции в клетках HEK-293T и лейкоцитах свиней, трансфицированных рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p5 и pCI-neo/ASFV/CD2v. Иммунизация свиней аутологичными лейкоцитов свиней, трансфицированными рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v, не индуцировала выработку вирусоспецифических антител и защиту от контрольного заражения.