Изучение антоцианов в кожуре и мякоти клубней гибридов картофеля (Solanum tuberosum L.)

Оригинальная статья / Original article УДК: 635.21:631.526.325:581.175.11

Антоцианы в растении относятся к вторичным метаболитам, а конкретно к группе флавоноидов. Они выполняют ряд важных функций, которые можно разделить на две основные группы: отношения расте-ние/насекомое и реакция на воздействие стрессовых факторов окружающей среды [1, 2]. В вегетативных тканях (листьях, стеблях) антоцианины поглощают видимое (сине-зеленое) и ультрафиолетовое излучение (UV-B) и являются мощными антиоксидантами и гасителями свободных радикалов, при этом они защищают фотосинтетический аппарат от воздействия, избыточного видимого или ультрафиолетового излучения и фотооксидативного стресса [3].

Антоцианы синтезируются в кожуре и мякоти клубней картофеля [4]. Известно, что флавоноиды в основном накапливаются в картофельной кожуре, богатой веществами, которые представляют фармакологический интерес [5]. У картофеля как важной продовольственной культуры содержание антоцианов целесообразно повышать в съедобной части растения – мякоти клубней [6]. Пигментированный картофель может служить потенциальным источником природных антоцианов, поскольку имеет невысокую стоимость и является распространенным продуктом питания [7]. Красный и пурпурный картофель содержит ацилированные глюкозиды пеларгонидина, тогда как пурпурный картофель – ацилированные глюкозиды мальвидина, петунидина, пеонидина и дельфинидина [8]. Генотипы картофеля различаются по содержанию биологически активных соединений, в том числе антоцианов. Пигментированные сорта обладают в 1,5-2,5 раза большей фенольной активностью, в 2-3 раза большей антиоксидантной способностью и накапливают больше антоцианов, чем непигментированные генотипы [9]. Известно, что антоцианы обладают капилляроукрепляющими, антиоксидантными, антибактериальными и антиканцерогенными свойствами и применяются в медицине для лечения и профилактики ряда заболеваний (например, сахарного диабета II типа и некоторых форм опухолей) [10]. Полифенолы, содержащиеся в мякоти и кожуре пигментированного картофеля, способствуют снижению уровня оксидативного стресса и воспалительных процессов у людей [11].

Отмечено, что после кулинарной обработки и длительного хранения количество антоцианов практически не изменяется [12, 13]. Перечисленные свойства антоцианов стимулируют вовлечение картофеля в программы селекции на высокое содержание этих пигментов в красной и фиолетовой мякоти и кожуре клубня [14].

В последние годы созданы сорта с высоким содержанием каротиноидов и антоцианов, отличающихся красной и фиолетовой мякотью клубней [15]. В США селекционная работа по созданию специальных диетических сортов ведется с начала 2000 г., в результате получены сорта с высоким содержанием каротиноидов и антоцианов, имеющие красную и фиолетовую мякоть клубней [6]. В России также достигнуты значительные успехи в создании сортов картофеля для диетического питания, проводятся исследования по определению суммарного содержания антиоксидантов в сортообразцах картофеля, выделены сорта, которые имеют наибольший индекс пигментации и содержат в 5 раз больше антиоксидантов, чем беломякотные сорта [16, 17]. Установлена положительная корреляция между содержанием антоцианов и других групп фенольных соединений в тканях клубней картофеля и антиоксидантной активностью [18, 19].

Изученность генетики антоциановой пигментации клубней и цветков у селекционных форм S. tuberosum существенно облегчает подбор родительских пар для скрещивания и планирование объемов селекционного материала при отборе гибридов с окрашенными цветками, стеблями, листьями и клубнями [21].

По данным Симакова Е.А. и др. [22] при измерении антиоксидантной активности (АОА) сортообразцов коллекционного питомника установлен ее высокий уровень (1032–1280 мг/кг) у гибридов с пигментированной окраской кожуры и мякоти клубней, отличающихся высоким содержанием каротиноидов и антоцианов, определяющих ее уровень.

Отбор на высокую питательную ценность по признаку окраски кожуры и мякоти является перспективным направлением. В настоящее время на Дальнем Востоке работы по изучению качественного и количественного состава антоцианов в клубнях картофеля новое направление. В 2018 г. в ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки совместно с ДВФУ (о. Русский) проведена оценка сортов различного происхождения (Россия, Нидерланды, Германия, Казахстан, Украина и Беларусь) выделены источники ценных хозяйственных признаков (повышенная урожайность, красная и фиолетовая окраска кожуры клубня, красно-фиолетовая окраска венчика), которые включены в скрещивания с целью получения диетических сортов [23].

Цель исследований – идентификация количественного и качественного состава антоцианов в клубнях ценных гибридов картофеля приморской селекции.

Материалы и методы исследований

Исходным материалом для исследований послужили пять перспективных гибридов картофеля ( Solanum tuberosum L.) селекции ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки». Сортообразцы характеризовались различными сроками созревания. Исследования проводили в период 2018-2023 годов. На их основе выделены перспективные гибриды с различными показателями антоцианов в клубнях (рис. 1). В качестве стандарта использован районированный сорт Янтарь.

Состав и накопление антоцианов анализировали по методу C.E. Lewis и др. [24] в Дальневосточном федеральном университете (г. Владивосток, Приморский край). Для определения содержания антоцианов использовали ткани мякоти клубней, кожуры, листьев и соцветий. Собранные образцы хранили до начала анализа (не более 2 нед.) в прохладном месте без доступа прямых солнечных лучей. Образцы промывали в холодной воде, взвешивали, измельчали и заливали раствором, содержащим 40 % этилового спирта и 1% муравьиной кислоты (5 г измельчен-

Рис. 1. Мякоть различных сортов картофеля

Fig. 1. Flesh ofdifferent potato varieties

ной массы + 25 мл полученного раствора). Массу подвергали замораживанию-размораживанию, а также ультразвуковой дезинтеграции для разрушения стенок и мембран клеток и органелл. Антоцианы экстрагировали в течение 90 мин при 40oС в закрытом сосуде для предотвращения доступа атмосферного кислорода. Экстракт центрифугировали (СМ-6М, «Elmi», Латвия) при 3500 g в течение 30 мин, супернатант фильтровали через шприцевые фильтры (размер пор 0,45 мкм). Готовый экстракт хранили в морозильной камере при температуре 20oС.

Антоцианы разделяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе с градиентным насосом высокого давления LC-20AD и блоком термостатирования колонок CTO-20A («Shimadzu», Япония). Хроматографию проводили на обратнофазной колонке Shodex C18-4E (250½4,6 мм), диаметр зерна сорбента – 5 мкм («Shodex», Япония), температура 50oС, скорость подвижной фазы составляла 0,58 мл/мин. Элюент А – ацетонитрил («AppliChem GmbH», Германия), элюент B – 1% раствор муравьиной кислоты («Sigma-Aldrich», США). Градиент: 0,00-5,00 мин – концентрация B изменялась от 100 до 92%; 5,00-45,00 мин – концентрация B изменялась от 92 до 80%; 45,00-45,01 мин – концентрация B изменялась от 80 до 10%. Детектирование проводили в диапазоне длин волн 300600 нм UV/VIS спектрофотометрическим детектором SPD-20A («Shimadzu», Япония). Для анализа вводили по 5 мкл экстракта. Анализ проводили в 84 биологических и 3 аналитических повторностях. Для гибридов с фиолетовым и сине-фиолетовым пигментом содержание антоцианов пересчитывали по мальвидин-3-глюкозиду, используя коэффициент поглощения 3,02½ 104 в диапазоне длин волн 300-600 нм и молекулярную массу 493,3 г/моль, для остальных образцов – по пеларгонидин-3-глюкозиду с молярным коэффициентом экстинкции 2,73½ 104 при диапазоне длин волн 300-600 нм и молекулярной массой 433,3 г/моль.

Антоцианы идентифицировали методами масс-спектрометрии второго порядка с помощью ловушки amaZon SL («Bruker», Германия), оснащенной источником ионизации электрораспылением. Для этого выделенные ранее методом ВЭЖХ антоцианины анализировали методом прямого ввода. Детектирование проводили в режиме положительных и отрицательных ионов. Диапазон сканирования масс – от 150 до 2200 а.е.м., максимальная скорость сканирования 32000 Да/с, напряжение на распыляющем капилляре 4500 В, давление на небулайзере 29 psi, поток сухого газа 10 л/с, температура капилляра 180oС. Фрагментацию ионов проводили электронным пучком с энергией 1,5 эВ. Анализ проводили в 15 биологических и 3 аналитических повторностях.

Для проверки достоверности полученных результатов использовали статистические программы MS Excel 2007 и

Statistica 8 («StatSoft, Inc.», США), рассчитывали средние (M) и t0,05½SEM.

Результаты исследований и их обсуждение

На первоначальном этапе эксперимента нами исследованы неочищенные клубни (изучался состав антоцианов в кожуре и мякоти в совокупности). У сортов с розовой и темно-розовой окраской клубня выявлено превалирующее присутствие пеларгонидин-3-глюкозида, гибриды с фиолетовой и сине-фиолетовой окраской содержали преимущественно петунидин-3-глюкозид и цианидин-3-глюко-зид (табл. 1).

В образцах с желтой окраской кожуры антоциановые вещества детектировали в незначительном количестве. В клубнях стандарта Янтарь детектирован петунидин-3-глю-козид – 1,8 мг/кг.

По суммарному количеству антоцианов в клубнях выделилась группа генотипов с фиолетовой и сине-фиолетовой кожурой – 137,7 и 223,3 мг/кг. Сортообразцы с розовым пигментом на клубнях характеризовалась количеством антоциановых компонентов в среднем от 2,5 до 70,3 мг/кг.

Наибольшее содержание антоцианов характерно для сортообразцов с розовой кожурой: При-15-7-16 (87,4 мг/кг), При-15-41-8 (85,1); фиолетовой кожурой – При-15-12-14 (137,7), При-14-52-2 (223,3 мг/кг). Выявлен генотип с многокомпонентным составом – 4 антоциана в совокупности: При-15-12-14 (петунидин-3-глюкозид, цианидин-3-глю-козид, цианидин-3-рамнозил-5-глюкозид, дельфинидин-3-рамнозил-5-глюкозид).

Мякоть клубней картофеля – кладезь углеводов, витаминов и антиоксидантов. Это основная часть растения, которая употребляется в пищу. В настоящее время разнообразие окраски мякоти варьирует от белой до фиолетовой. Сортообразцы с цветной мякотью обладают особой ценностью, так как считаются источниками антиоксидантов, в том числе антоцианов. В Государственном реестре селекционных достижений РФ за 2022 г. включено всего два сорта с пигментированной мякотью: Сюрприз (розовая мякоть) и Фиолетовый (фиолетовая мякоть), из них ни один не допущен для выращивания в Дальневосточной зоне. В связи с этим в 2019 г. детекцию антоцианового профиля клубней провели в двух частях, разделив кожуру и мякоть. При сравнении количественного и качественного состава антоцианов в кожуре и мякоти клубней были получены результаты, свидетельствующие о том, что максимальное содержание компонентов находится в кожуре и ближе к ней.

При исследовании сортообразцов с розовой и красной окраской клубня выявлено превалирующее присутствие пеларгонидина и дельфинидина. Редко встречающимся антоцианом отмечен мальвидин (табл. 2).

Генотипы выделенной группы существенно превышали

Таблица 1. Содержание антоцианов в клубнях у изученных гибридов картофеля в зависимости от окраски кожуры Table 1. Content of anthocyanins in the tubers of the studied potato hybrids in relation to their skin color

Сорт, гибрид

Антоциан

Молекулярный ион [М+Н]+

Время выхода на ВЭЖХ, мин.

Содержание антоцианов, мг/кг

Желтая и кремовая окраска кожуры клубня
Янтарь, st	Pt3Glu	479,3; 317,2	35,0	1,8±0,1
Желтая окраска кожуры клубня с розовыми пятнами, розовая и красная окраска
При-15-7-16 Ирбитский × Аврора	Dp3Glu	465,3; 303,2	25,0	14,6±0,1
	Pl3Glu	433,3; 271,1	37,5	70,3±0,3
	Mv3Glu	493,3; 331,3	44,0	2,5±0,1
При-15-41-8 Русская красавица × Ирбитский	Pl3Glu	433,3; 271,1	37,5	63,2±0,3
	Mv3Glu	493,3; 331,3	44,0	9,6±0,1
	Dp3Glu	465,3; 303,2	25,0	12,3±0,1
При-12-35-4	Dp3Glu	465,3; 303,2	25,0	2,9±0,1
Дебрянск × Мустанг	Pl3Glu	433,3; 271,1	37,5	59,1±0,3
Фиолетовая и сине-фиолетовая окраска кожуры клубня
	Pt3Glu	479,3; 317,2	35,0	125,0±0,3
При-15-12-14	Cy3Glu	449,2; 287,2	27,5	1,2±0,1
Purple potato × Манифест	Cy3Ram5Glu	611,3; 499,3; 287,2	19,0	3,6±0,1
	Dp3Ram5Glu	627,3; 465,3; 303,2	17,5	7,9±0,1
При-14-52-2 Ломоносовский × Purple potato	Pt3Glu	479,3; 317,2	35,0	124,1±0,3
	Cy3Glu	449,2; 287,2	27,5	85,6±0,2
	Pl3Glu	433,3; 271,1	37,5	13,6±0,1

Примечание. Pt3Glu – петунидин-3-глюкозид; Mv3Glu – мальвидин-3-глюкозид; Pl3Glu – пеларгонидин-3-глюкозид; Dp3Ram5Glu – дельфинидин-3-рамнозил-5-глюкозид; Dp3Glu – дельфинидин-3-глюкозид; Cy3Ram5Glu – циани-дин-3-рамнозил-5-глюкозид; Cy3Glu – цианидин-3-глюкозид; Pt3Ara – петунидин-3-арабинозид контрольный сорт Янтарь по количественному содержанию антоцианов. Наибольшее содержание антоцианов характерно для сортообразцов с розовой кожурой – При-15-7-16 (87,4 мг/кг), При-15-41-8 (85,1 мг/кг). Сортообразцы с кожурой клубня розовых и красных оттенков характеризовались повышенным содержанием анто- цианов в среднем 73,8 мг/кг в кожуре и незначительным количеством веществ в мякоти – 1,5 мг/кг. Отмечен высокий коэффициент вариации – 15,7-39,7%.

Сорта с фиолетовой и сине-фиолетовой окраской содержали преимущественно петунидин-3-глюкозид и цианидин-3-глюкозид. Наибольшее количество антоциа-

Таблица 2. Содержание антоцианов в кожуре и мякоти клубней у гибридов картофеля Table 2. Content of anthocyanins in the skin and flesh of the tubers of the studied potato hybrids

Сорт/гибрид	Антоциан	Происхождение	Содержание антоцианов, мг/кг
			клубень	кожура	мякоть
Янтарь, st                              Pt3Glu		Россия	1,8±0,1	1,2±0,1	< 0,5
При-15-7-16 Ирбитский × Аврора	Dp3Glu	Россия	14,6±0,1	2,0±0,1	< 0,5
	Pl3Glu		70,3±0,3	204,1±0,3	< 0,5
	Mv3Glu		2,5±0,1	10,8±0,1	< 0,5
	Pt3Ara		-	40,1±0,2	1,4±0,1
	Cy3Glu		-	99,1±0,2	2,3±0,1
При-15-41-8 Русская красавица × Ирбитский	Pl3Glu	Россия	63,2±0,3	130,1±0,4	< 0,5
	Mv3Glu		9,6±0,1	5,2±0,1	< 0,5
	Dp3Glu		12,3±0,1	15,0±0,1	< 0,5
	Pt3Ara		-	16,7±0,1	< 0,5
	Cy3Glu		-	4,5±0,1	< 0,5
При-12-35-4 Дебрянск × Мустанг	Dp3Glu	Россия	2,9±0,1	3,5±0,1	1,2±0,1
	Pl3Glu		59,1±0,3	110,1±0,2	< 0,5
	Pt3Ara		-	7,8±0,1	< 0,5
При-15-12-14	Pl3Glu	Россия	125,0±0,3	114,0±0,3	12,6±0,2
	Pt3Ara		-	350,0±0,5	91,1±0,3
	Cy3Glu		140,2±0,4	39,8±0,2	1,2±0,1
	Cy3Ram5Glu		-	-	3,6±0,1
Purple potato × Манифест	Dp3Ram5Glu		-	-	7,9±0,1
	Dp3Glu		-	63,1±0,1	1,7±0,1
	Pl3Glu		-	5,0±0,1	< 0,5
	Mv3Glu		-	10,0±0,1	1,0±0,1
При-14-52-2	Pt3Glu	Россия	124,1±0,3	-	-
	Pt3Ara		-	357,9±0,5	143,0±0,4
	Cy3Glu		85,6±0,2	80,4±0,1	81,2±0,3
Ломоносовский × Purple potato
	Pl3Glu		13,6±0,1	84,1±0,2	1,2±0,1
	Dp3Glu		-	10,1±0,1	1,5±0,1
	Mv3Glu		-	2,1±0,1	1,1±0,1

Знак «-» - антоцианы не обнаружены

Рис. 2. Профиль элюции антоцианов, выделенных из кожуры (а) и мякоти (б) клубней картофеля гибрида При-14-52-2

Fig. 2. Elution profile ofthe anthocyanins isolated from the skin (a) and flesh (b) ofthe tubers ofpotato variety Pri-14-52-2

нов отмечено у сортообразцов с фиолетовой кожурой – При-15-12-14 (137,7 мг/кг), При-14-52-2 (223,3 мг/кг).

Мякоть клубней фиолетового цвета обладает высоким содержанием антоцианов, на уровне состава кожуры. Генотипы с фиолетовыми клубнями отличились содержанием антоциановых компонентов в обеих частях клубня и в среднем их количество составило: в кожуре – 334,9 мг/кг и мякоти – 80,3 мг/кг.

Выявлен генотип с многокомпонентным составом – 8 антоцианов: При-15-12-14.

Ранее проведенные исследования подтверждают, что качественный состав антоцианов, как правило, специфичен и зависит от сортовых особенностей и условий произрастания растений, которыми определяется активность соответствующих ферментов, способствующих синтезу определенных компонентов антоцианового комплекса [7]. Сорта с фиолетовой и розовой кожурой разных оттенков выделились по содержанию антоцианов в клубнях по сравнению с сортообразцами с желтыми клубнями. Следовательно, окраска кожуры клубня (розовая, темнорозовая, сине-фиолетовая, фиолетовая) может использоваться в качестве визуального признака в селекции при создании диетических сортов с повышенным содержанием антоцианов. Исследованиями установлена связь розовой и темно-розовой окраски кожуры с повышенным содержанием пеларгонидин 3-глюкозида, в пределах 6395 мг/кг. В результате изучения получен патент на изобретение «Способ отбора сортообразцов картофеля с повышенным содержанием антоцианов» (№2723406, получен 11.06.2020 г. с датой приоритета 09.12.2019 г.).

В клубнях гибрида При-14-52-2 петунидин-3-арабинозид является основным компонентом, и в больших количествах обнаружен в кожуре и мякоти образца (рис. 2).

Во время фиксации детекции обнаружен интенсивный сигнал при длине волны 510 нм (время удерживания 15,5 мин), что соответствует основному антоциану – петунидин-3-арабинозиду гибрида При-14-52-2, кроме того, присутствовал в значительных количествах пеларгонидин-3-глю-козид (пик при 14,9 мин). При анализе мякоти гибрида При-14-52-2 зафиксирован пик с интенсивным сигналом на

14,3 мин., что соответствует петунидин-3-арабинозиду. Также отмечен сигнал на 10,5 мин. – где был идентифицирован цианидин-3-глюкозид. Профили элюции выявили связь между содержанием конкретных антоцианов и окраской клубней, а также их принадлежностью к определенному сортообразцу.

В результате проведенного анализа компонентного состава клубня тканей кожуры и мякоти отмечены сорто-образцы с содержанием антоцианов в обеих частях клубня: При-15-12-14 (петунидин-3-арабинозид: 310,0 и 91,1 мг/кг; цианидин-3-глюкозид: 149,8 и 39,8 мг/кг), При-14-52-2 (петунидин-3-арабинозид: 360,0 и 143,0 мг/кг; цианидин-3-глюкозид: 80,4 и 81,2 мг/кг). Выделившиеся образцы имеют окрашенную кожуру: фиолетовую и сине-фиолетовую. Мякоть с фиолетовым пигментом была свойственна генотипам –При-14-52-2 и При-15-12-14. Гибриды При-15-12-14 и При-14-52-2 отличились наибольшим содержанием суммарного количества антоцианов в мякоти – 130,9 и 224,2 мг/кг соответственно.

Заключение

В результате исследований в клубнях выявлено восемь различных антоцианов. После проведения масс-спектрометрии второго порядка, выделенные антоцианы идентифицированы как дельфинидин-3-глюкозид, дельфини-дин3-рамнозил-5-глюкозид, петунидин-3-глюкозид, маль-видин-3-глюкозид, цианидин-3-глюкозид, цианидин-3-рам-нозил-5-глюкозид, пеларгонидин-3-глюкозид, петунидин-3-арабинозид. Установлено, что для клубней с розовой и красной кожурой характерно наличие пеларгонидин-3-глюкозида. Петунидин-3-глюкозид и цианидин-3-глюкозид обеспечивают фиолетовую окраску кожуры. Детекция антофианового профиля в кожуре и мякоти клубня картофеля позволила выделить генотипы, являющиеся источниками повышенного содержания антоцианов: При-15-12-14 Purple potato × Манифест, При-14-52-2 Ломоносовский × Purple potato, которые находятся в питомниках конкурсного сортоиспытания. Выделенная группа сортообразцов рекомендуется для использования в диетическом питании и целенаправленном селекционном процессе.

Aboutthe Authors:

Irina V.Kim – Dr. Sci. (Agriculture),

Leading Researcher,

Laboratory for Diagnostics of Potato Diseases, Correspondence Author, ,

Alexey G.Klykov – Dr. Sci. (Biology),

Academician of RAS, Head of the Department of the Breeding and Biotechnology of Agricultural Crops,

ISSN 2618-7132 (Online) Овощи России №2 2024     [ 105 ] Vegetable crops of Russia №2 2024 ISSN 2072-9146 (Print)