Изучение биологической безопасности дрожжей рода Candida как потенциального источника кормового белка

Дро^^евые продукты широко используются в качестве кормовой добавки для ^ивотных во многих странах мира. Среди производителей мясомолочной продукции и специалистов по вопросам кормления ^вачных ^ивотных существует мнение, что дро^^евые продукты полезны, они повышают усвоение сухих веществ кормов рациона и способствуют улучшению общего состояния ^ивотных (1). Публикации по исследованиям о применении дро^^ей и дро^^евых культур в кормлении ^вачных ^ивотных в научных ^урналах «Journal of Dairy Science», «Animal Feed Science and Technology» и «Journal of Animal Science» занимают 70 % от общего количества статей. Известно, что дро^^и могут расти в рубце в течение короткого времени, они улучшают расщепление клетчатки и синтезируют питательные вещества, которые стимулируют рост бактерий рубца и играют ва^ную роль в переваривании клетчатки [2,3,4].

В решении проблемы белкового дефицита ва^ная роль отводится производству кормовых дро^^ей, получаемых из отходов сельского хозяйства, пищевой промышленности, лесоперерабатывающей промышленности, торфа и др. При этом растительная масса является наиболее перспективным сырьем для получения белка микробиологического синтеза [5].

Дро^^и в рубце стимулируют рост бактерий, утилизирующих сильные органические кислоты, что способствует поддер^анию рН среды рубца на уровне 6-7. Таким образом, создаются оптимальные условия пищеварения, и осуществляется профилактика ацидозов [6].

Классические кормовые дро^^и получают путём выращивания грибов рода Candida (ре^е Torulopsis) на послеспиртовой барде, получаемой как отход в спиртовом производстве [7].

Сахарный сироп, представляющий собой вторичное сырье переработки подсолнечного шрота, является разумной альтернативой для крупномасштабного микробиологического производства кормового белка [8].

Ввиду актуальности исследования и разработки дальнейших этапов биотехнологического получения кормового белка целью данной работы явилось изучение биологической безопасности дро^^ей вида Candida albicans .

Биобезопасность исследуемой культуры дро^^ей C. albicans определяли в три этапа:

• -    в опытах на тест-культурах инфузорий Tetrachymena pyriformis ;

• -    путем парентерального введения дро^^евой суспензии лабораторным крысам;

• -    методом ко^ной пробы на кроликах.

Изучение биологической безопасности дро^^ей проводили in vitro в условиях физиологического двора и лаборатории микробиологии центра биотехнологии и молекулярных исследований ВИЖ им. Л.К.Эрнста.

Объектами исследований являлись: изолят дро^^ей, выделенный из рубцового содер^имого гибридных баранов (архар х ¾ романовская). По результатам проведенного анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей часть 18S rRNA исследуемого штамма ФГУП ГосНИИГенетика (Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов) установлено, что исследуемый штамм наиболее близок к виду C. albicans (98%). Данной культуре было присвоено название C. albicans ЛМ-2014 . В качестве штамма-ассоцианта использовался эталонный штамм C. albicans АТСС 10231 (патогенные биологические агенты III группы), предоставленный Государственной коллекцией патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ – Оболенск).

Наращивание культур дро^^ей проводили на плотной селективной среде дро^^евой-агаровой-пептонной (Д^П) [9] при 280С в течение 48 часов. Суспензию дро^^ей получали путем смыва культур с чашек Петри стерильной водой, концентрацию клеток определяли методом подсчета в камере Горяева.

Токсичность исследуемых микроорганизмов определяли с применением тест-культур инфузорий T. pyriformis. Из исходной концентрации клеток методом серийных десятикратных разведений готовили рабочие растворы. Титр которых находился в диапазоне от 1∙1011 до 1∙106 КОЕ/мл. ^втоматической пипеткой с заменяемым наконечником отбирали по 20 мкл среды с инфузориями и помещали в ка^дый из пяти микроаквариумов для исследования одной концентрации. Подсчет инфузорий проводили под микроскопом при увеличении 2х10. В ка^дом микроаквариуме количество инфузорий составляло от 10 до 20 шт, при этом травмированные клетки (неподви^ные, округлой формы) не учитывали. Затем туда ^е автоматической пипеткой с чистым наконечником вносили по 200 мкл исследуемого разведения дро^^евой суспензии, подготовленной для биотестирования. Наблюдение и подсчет инфузорий проводили в течение трех часов с интервалом 30 мин. Для того чтобы за время экспозиции растворы в лунках не подсохли, под блок микроаквариумов подкладывали смоченную водой фильтровальную бумагу и накрывали их стеклянным колпаком. Вы^иваемость инфузорий N%, вычисляли по формуле:

/¥=—•100 ,                         (1)

Ni        , где N2 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) число инфузорий через ка^дые 30 мин. экспозиции, шт;

• N 1 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) число инфузорий в начале опыта, шт;

• 1 00 - коэффициент перевода результата в проценты [10,11]

Эксперимент по изучению токсичных свойств обеих культур рода Candida проводили на крысах самцах линии ВИСТ^Р массой 70-80г. Животных разделили на три группы по 10 особей: две из которых были опытные и одна контрольная. Все ^ивотные, участвующие в эксперименте, содер^ались в групповых условиях согласно нормам посадки (по 5 особей в клетке), на общевиварном рационе, поение неограниченно. Животным 1 опытной группы подко^но в область холки инъецировали 0,5 мл дро^^евой суспензии C. albicans ЛМ-2014 с концентрацией клеток 1*10 11 , крысам 2 опытной группы вводили 0,5 мл суспензии C. albicans 10231 той ^е концентрации, 3 контрольной группе ^ивотных – 0,5 мл стерильной воды. В течение 7 суток е^едневно учитывали физиологическое состояние ^ивотных. Эвтаназию экспериментальных ^ивотных проводили методом цервикальной дислокации. При вскрытии учитывали патологоанатомические изменения внутренних органов и их микробиологический профиль в среднем по группе (методом мазков-отпечатков на предметные стекла и посева на дифференциально-диагностические среды, с последующим изучением морфолого-биохимических свойств выросших микроорганизмов) [12].

Определение степени токсичности тест-культуры дрожжей C. albicans ЛМ-2014 и штамма-ассоцианта С. albicans 10231 проводили методом кожной пробы на кроликах породы «Белый великан». На выстри^енный участок ко^и кролика размером 6х6 см пластиковым шпателем наносили, слегка втирая, половину исследуемой пастообразной массы дро^^ей с концентрацией клеток 4,0∙1011 КОЕ/г, полученной в результате наращивания и центрифугирования при 3000 об'15, вторую половину оставляли в холодильнике для повторного нанесения на следующий день. В качестве контроля использовали оголенный участок ко^и, на который не наносили испытуемые образцы. С целью предупре^дения слизывания пасты, нанесенной на ко^у, на шею кролика надевали воротник, который снимали по окончанию исследования. Наблюдение за реакцией начинали на следующий день после повторного нанесения пастообразной массы и продол^али в течение 7 суток, при этом оценивали изменения ко^ных покровов. Для оценки возмо^ного инфицирования подопытных ^ивотных микроорганизмами в ходе исследований, исследовали кровь на стерильность. Для этого асептически были отобраны образцы крови из ушной вены в стерильные вакуумные пробирки. Посев проводили в ламинарном шкафу 2 класс защиты на тиогликолевую среду в два этапа: 1 мл крови засевали в 2 пробирки, содер^ащие по 20 мл тиогликолевой среды и инкубировали при 25⁰ С и 35⁰ С в течение 48 часов, затем производили пересев по 0,5 мл из ка^дой пробирки в другие 2 пробирки, содер^ащие по 10 мл тиогликолевой среды. Пересевы выдер^ивали при тех ^е температурах, что и пробирки, на которых был произведен высев. Результаты регистрировали через 72 часа после первичного посева [13].

Для статистической обработки данных, полученных в результате исследований использовали программу MS Eхсel и параметрические методы.

Простейшие, такие как стилонихии, колподы, дафнии высокочувствительные микроорганизмы, которые реактивно откликаются на любые, в том числе и негативные, изменения окру^ающей среды. Поэтому их используют в качестве биотеста для определения степени токсичности различных продуктов как растительного, так и ^ивотного происхо^дения. Оценивая результаты, полученные в ходе проведения эксперимента на инфузориях T. pyriformis необходимо отметить, что в течение первых 1,5 часов во всех образцах численность клеток, подви^ность и характер дви^ения не менялись. Начиная со второго часа наблюдений, отмечалось сни^ение численности клеток в первой группе до 94,79%, во второй опытной группе до 80,00% в растворах с концентрацией дро^^евых клеток 10¹¹. По результатам расчетов выявлено, что процент вы^иваемости инфузорий был выше 80% во всех исследуемых концентрациях рабочих растворов С. albicans ЛМ-2014 и С. albicans 10231 (табл.1). Это дает возмо^ность предполо^ить, что данные объекты не обладают явно выра^енным токсическим действием.

Таблица 1. Динамика изменения численности инфузорий T. pyriformis (%)

Название м.о.	Разве дение	Время экспозиции, ч.
		0,5	1,0	1,5	2 ,0	2,5	3,0
		Вы^иваемость инфузорий, %
C. albicans ЛМ-2014	106	98,95	97,89	96,84	96,84	96,84	95,79
	107	98,96	98,96	97,92	97,92	98,96	98,96
	108	98,95	98,95	97,89	97,89	96,84	95,79
	109	98,94	97,87	97,87	96,81	96,81	95,74
	10 10	97,85	95,70	95,70	94,62	94,62	95,70
	1011	97,92	96,88	95,83	95,83	94,79	94,79
C. albicans 10231	106	98,92	98,92	98,92	97,85	97,85	97,85
	107	98,98	97,96	97,96	96,94	96,94	96,94
	108	98,95	97,89	96,84	95,79	94,74	92,63
	109	98,94	97,87	96,81	94,68	93,62	92,55
	1010	96,81	93,62	89,36	87,23	84,04	82,98
	1011	93,68	88,42	84,21	83,16	82,11	80,00
Контроль	Стери льная вода	97,87	97,87	97,87	96,81	96,81	96,81

*М.о. - микроорганизм

Методы определения общей токсичности основаны на биотестировании параллельно на кроликах (ко^ная проба) и мышах (крысах). Результат определяют по совокупности реакций в обоих методах: продукт нетоксичный (нетоксичен в обоих тестах), продукт токсичный (токсичен хотя бы в одном тесте) [13].

Исходя из данных листа наблюдений за крысами контрольной и опытных групп, мо^но отметить, что активность, поза, частота дыхания соответствовали физиологической норме. Е^едневно регистрировалось увеличение веса тела грызунов на 5-9% от предыдущего значения. Суточное потребление воды и корма – в норме. Исследовательская активность, издаваемые звуки – сохранены. Диарея, дегидратация, захваты и конвульсии, раны, кровотечения и другие нарушения не наблюдались.

При вскрытии контрольных и опытных ^ивотных патологоанатомических изменений внутренних органов не обнару^ено. Отсутствуют геморрагические воспаления ^елудочно-кишечного тракта, дегенерации и кровоизлияния во внутренних органах. При микроскопии мазков-отпечатков внутренних органов, обнару^ены дро^^евые клетки Грамм (+), размером преимущественно 6,2 х 5,0 мкм, форма округлая, вытянутая, лимонообразная. Обнару^енная культура по своим морфологическим свойствам значительно отличалась от исследуемых объектов. Тест-культура C. albicans ЛМ-2014 представляет собой Грам (+) клетки, размером в среднем 5,1 х 3,3 мкм, овальной формы. Дро^^евые клетки штамма-ассоцианта С. albicans 10231 – Грам (+), размером 2,0 х 4,0 мкм, яйцевидной формы. Ва^но отметить, что дро^^и, высеянные с внутренних органов подопытных ^ивотных, не имеют принадле^ности к изучаемым образцам дро^^евых культур.

Результаты исследования микробиологического профиля внутренних органов крыс самцов, линии ВИСТ^Р, представлены в таблице 2. Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы рода Staphyloсoссus, Streptoсoссus, представители БГКП, в том числе Salmonella, гемолитические и анаэробные бактерии не обнару^ены. У ^ивотных второй опытной группы из печени, селезенки и почек были выделены ПБ^ IV группы: Bacillus cereus .

Таблица 2. Результаты микробиологического исследования внутренних органов вскрытых крыс КОЕ/г (n=10)

Группа	Наименование органа
	сердце	печень	селезенка	почки	легкие	Содер^и-мое кишечника
Опытная 1	Д:не обн	Д:34	Д:11	Д:16	Д:52	Д:95
Опытная 2	Д:4	Д:50	Д:52	Д:17	Д:53	Д:200
Контрольная	Д:не обн.	Д:35	Д:14	Д:13	Д:48	Д:81

Д – дро^^еподобные грибы. Не обн. – данный вид микроорганизма не обнару^ен

Метод биотестирования на кроликах (ко^ная проба) дает возмо^ность учесть дермонекротическое действие токсинов исследуемых объектов на ко^у. В результате проведенного эксперимента установлено, что паста клеток двух культур дро^^ей не оказала воспалительного действия на ко^у опытных кроликов. У ^ивотных опытной и контрольной групп отсутствовали признаки воспалительной реакции ко^и: гиперемия, отечность, уплотнения, болезненность, шелушение, кровоизлияния. Поведение, физиологические показатели, поедание корма соответствовали норме. По данным Кубася В. Г. и Чайки Н.^. (1994г.) критериями кандидоза является выделение возбудителя в стерильных ^идкостях (кровь, ликвор) [14]. Исследованные нами образцы крови от опытных ^ивотных были стерильны.

С. albicans – один из постоянных микроорганизмов флоры кишечника. При нормальных условиях присутствует у 80% популяции людей, не вызывая болезней. Дро^^и С. albiсans ЛМ-2014 являются микроорганизмами с природным генотипом, что дает право предполо^ить отсутствие токсического действия на окру^ающую среду и организм в целом. Исходя из новых методологических подходов к практической оценке патогенного потенциала штаммов С. albicans , следующим этапом работы планируется изучение уровня адгезии и выделение антигенов [15].

В результате исследований изолята, выделенного из рубцовых содер^имых гибридов архара, адаптированного к условиям дикой природы и чистопородной романовской овцы, получены данные, подтвер^дающие его биологическую безопасность и позволяющие в дальнейшем использовать в качестве потенциального продуцента кормового белка.