Изучение биотехнологического потенциала штамма Lactobacillus sakei LSK-103

*Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ, Россия; e-mail: , ORCID:

Никифорова А. П. и др. Изучение биотехнологического потенциала штамма Lactobacillus sakei LSK-103. Вестник МГТУ. 2021. Т. 24, № 3. С. 277–286. DOI:

*East Siberia State University of Technology and Management, Ulan-Ude, Russia; e-mail: , ORCID:

Nikiforova, A. P. et al. 2021. The study of biotechnological potential of Lactobacillus sakei LSK-103. Vestnik of MSTU, 24(3), pp. 277–286. (In Russ.) DOI:

В последние годы ассортимент ферментированных продуктов питания значительно увеличился. Они имеют уникальные органолептические характеристики, также известно, что употребление ферментированных продуктов связано с многочисленными преимуществами для здоровья. При производстве ферментированных продуктов часто применяются молочнокислые бактерии, роль которых заключается в формировании качества готового продукта, в том числе вкуса и аромата, повышении безопасности за счет антагонистической активности против патогенных микроорганизмов.

Ферментированные рыбные продукты традиционно производятся во многих странах мира. Для них характерны уникальные вкус и аромат. Считается, что при производстве ферментированных рыбных продуктов при формировании характерных органолептических свойств важную роль играют не только ферменты, но и микроорганизмы ( Skåra et al., 2015 ). Большой научный интерес имеет применение бактериальных культур при производстве рыбных продуктов, что позволяет сделать процесс производства более управляемым, сократить продолжительность ферментации, улучшить характеристики продукта ( Speranza et al., 2015 ).

В связи с этим разрабатываются бактериальные препараты, содержащие молочнокислые микроорганизмы, которые могут применяться для производства пищевых продуктов. Этому вопросу посвящены исследования российских и зарубежных ученых ( Speranza et al., 2015; Tsuda et al., 2012; Занданова и др., 2019; Китаевская и др., 2014; Пономарева и др., 2017 ). При этом особый научный интерес имеет изучение биотехнологического потенциала микроорганизмов, который отвечает за эффективность и надежность бактериальных препаратов. Ценность штаммов определяется способностью сохранять высокую биохимическую активность, зависящую от внешних факторов и от соотношения между биохимически активными и неактивными клетками в популяциях микроорганизмов ( Китаевская, 2012 ).

Применяемые штаммы должны быть способны противостоять неблагоприятным условиям, которые возникают при производстве бактериальных препаратов, например, в процессе сушки и хранения (при сублимационной сушке и замораживании). Для пробиотических штаммов важной является способность выживать в пищеварительном тракте человека. Однако бактерии могут подвергаться воздействию стрессовых факторов не только при прохождении через пищеварительную систему, но и при производстве, в природных условиях, когда важна способность быстро реагировать на стресс ( van de Guchte et al., 2002 ).

Так, многие бактерии развили системы чувствительности к стрессу и защиты от него. Это позволяет им противостоять суровым условиям и внезапным изменениям окружающей среды. Механизмы защиты от стресса у бактерий различны и зависят от многих факторов ( van de Guchte et al., 2002 ).

Ответы на стресс у бактерий зависят от скоординированной экспрессии генов, которые влияют на различные клеточные процессы, такие как деление клеток, метаболизм ДНК, и другие. Интеграция этих стрессовых реакций осуществляется сетями регуляторов, которые позволяют клеткам бактерий реагировать на изменения условий окружающей среды ( van de Guchte et al., 2002 ). Большое количество исследований посвящено изучению стрессовых реакций бактерий ( Boor, 2006; Ezraty et al., 2017; Hews et al., 2019 ). Наиболее изученными являются механизмы защиты от неблагоприятных факторов таких штаммов, как Escherichia coli и Bacillus subtilis ( van de Guchte et al., 2002 ).

Ухудшение экологической ситуации, приводящее к снижению защитных сил организма человека и всплеску заболеваний, связанных с нарушением бактериального баланса в желудочно-кишечном тракте, обусловливает постоянный интерес к изучению адаптационных механизмов молочнокислых бактерий. Внимание исследователей к изучению способности молочнокислых бактерий переживать неблагоприятные условия вызвано как теоретическим интересом, так и необходимостью создания пищевых продуктов с жизнеспособными клетками пробиотических микроорганизмов, длительное время сохраняющими способность к пролиферации, а при попадании в желудочно-кишечный тракт быстро адаптирующимися и возобновляющими активный метаболизм ( Ishibashi et al., 2001; Голод и др., 2009 ).

Способность молочнокислых бактерий противостоять различным неблагоприятным факторам была объектом изучения многих ученых ( Papadimitriou et al., 2016; van de Guchte et al., 2002 ). Достаточно хорошо изучены реакции молочнокислых бактерий на низкие значения рН, высокие и низкие температуры культивирования.

Одним из перспективных для применения в пищевой промышленности видов молочнокислых бактерий являются бактерии вида Lactobacillus sakei ( Zagorec et al., 2017; Никифорова и др., 2019 ).

Известно, что бактерии вида Lactobacillus sakei относятся к молочнокислым бактериям. Несмотря на это они считаются типично мясными штаммами ( Nyquist et al., 2011; Zagorec et al., 2017 ). Это связано с тем, что многие штаммы этого вида способны к активному росту в мясных и рыбных продуктах. Эта особенность обусловлена способностью бактерий данного вида ферментировать рибозу, которая присутствует в сыром мясе. Кроме того, Lactobacillus sakei способны использовать альтернативные источники углерода, такие как нуклеозиды или N-ацетилнейраминовую кислоту, также присутствующие в мясе ( Zagorec et al., 2017 ). Многие штаммы Lactobacillus sakei могут расти при низких положительных температурах и в присутствии поваренной соли ( Nyquist et al., 2011 ).

Бактерии данного вида широко применяются при производстве ферментированных колбас ( Amadoro et al., 2015; Papamanoli et al., 2003; Zagorec et al., 2017 ). Они присутствуют и играют важную роль в формировании желательных свойств ферментированных традиционных продуктов из рыбы ( Bjerke et al., 2019; Skåra et al., 2015 ). Кроме мясных и рыбных продуктов они входят в состав естественной микрофлоры продуктов питания из растительного сырья, например, заквасок из гречихи и тефа, применяемых при производстве хлеба, квашеной капусты и кимчи ( Jung et al., 2014; Moroni et al., 2011 ).

Бактерии Lactobacillus sakei имеют большой потенциал применения в качестве пробиотиков. Так, установлено, что пероральный прием препарата, содержащего как живые, так и термоинактивированные клетки штамма Lactobacillus sakei proBio-65, выделенного из кимчи, подавляют воспаление кожи при атопическом дерматите и активацию тучных клеток ( Kim et al., 2013 ).

Целью данной работы является изучение биотехнологического потенциала штамма Lactobacillus sakei LSK-103.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования проводились на кафедре технологии молочных продуктов, товароведения и экспертизы товаров Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления (ВСГУТУ).

Объектом исследования служил штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-103, полученный из фонда Национального биоресурсного центра – Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (ГосНИИгенетика).

Известно, что штамм Lactobacillus sakei LSK-103 был выделен из сыровяленых испанских колбас. В процессе ферментации он способен синтезировать молочную кислоту, аммиак, а также бактериоцины. Указанный штамм является антагонистом Esherichia coli , Proteus vulgaris , Salmonella typhimurium . Культуральноморфологические особенности штамма Lactobacillus sakei LSK-103: бактерии представляют собой грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся поодиночке или цепочками по 3–4 клетки. Колонии мелкие, округлой формы, с ровными краями.

При проведении экспериментальных исследований молочнокислые бактерии культивировали на полужидкой среде MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) (НПЦ "Биокомпас-С") и обезжиренном молоке при температуре 37 °С.

Для определения способности молочнокислых бактерий расти в присутствии хлорида натрия бактерии культивировали на среде с добавлением поваренной соли в различных концентрациях (0–10 %). Рост биомассы контролировали по оптической плотности.

Оптическую плотность (OD) определяли с применением спектрофотометра PD-303 (APEL, Япония) при длине волны 590 нм.

Толерантность бактерий к желчи определяли по методике, изложенной в работе ( Tsuda et al., 2012 ), с небольшими изменениями. В соответствии с ней в питательную среду MRS с содержанием желчи 0, 20 и 40 % вносили инокулят изучаемого штамма бактерий. После инокуляции питательные среды инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов. Затем проводили количественный учет жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий.

При изучении способности штамма выживать при различных значениях рН, рН питательной среды доводили до необходимого значения путем добавления 1М раствора соляной кислоты или 1М раствора гидроксида натрия.

Устойчивость изучаемого штамма к фенолу определяли после его культивирования в течение 24 часов при 37 °С в питательной среде с содержанием фенола 0,4 %.

Количественный учет молочнокислых микроорганизмов проводили методом предельных разведений на агаризованной среде MRS (НПЦ "Биокомпас-С", Россия).

Активную кислотность питательной среды определяли при использовании рН-метра "Анион-4100" (НПП "Инфраспак-Аналит", Россия), оснащенного комбинированным электродом ЭСК-10601/7.

Морфологические изменения клеток Lactobacillus sakei LSK-103 изучали с применением микроскопа "Микмед-6" (ЛОМО, Россия). Для этого предварительно готовили препараты и окрашивали их по Граму.

Статистический анализ полученных результатов проводили при использовании стандартных функций программы Microsoft Excel 2010. При этом для каждой характеристики измерение проводили в двух повторностях, производили расчет среднего значения и ошибки средней величины. Нулевая гипотеза отклонялась при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе экспериментальных исследований изучали биохимическую активность штамма Lactobacillus sakei LSK-103 на полужидкой среде MRS при оптимальной температуре 37 °C. Результаты исследований представлены на рис. 1.

Анализ представленных данных свидетельствует об активном росте Lactobacillus sakei LSK-103 на среде MRS. Через 16 часов культивирования в конце экспоненциальной фазы количество жизнеспособных клеток составляет 10⁹ КОЕ/см³ и в дальнейшем в стационарной фазе роста остается на прежнем уровне. Рост культуры сопровождается образованием молочной кислоты, что приводит к снижению активной кислотности до значения, равного 4,28.

Рис. 1. Динамика численности клеток и активной кислотности при культивировании Lactobacillus sakei LSK-103 на полужидкой среде MRS Fig. 1. Changes in the number of Lactobacillus sakei LSK-103 cells and pH of the medium during cultivation on a semi-liquid MRS medium

Культивирование Lactobacillus sakei LSK-103 на молочной среде не привело к положительному результату. Вероятно, это связано с тем, что штамм не сбраживает лактозу. Полученные результаты согласуются с уже известными данными о том, что не все штаммы вида Lactobacillus sakei способны ферментировать лактозу ( Amadoro et al., 2015; Obst et al., 1992 ). Так, только два из шести изучаемых в работе Amadoro et al. штаммов Lactobacillus sakei были способны ферментировать лактозу.

При разработке бактериального препарата, предназначенного для производства рыбных и мясных продуктов, следует принимать во внимание устойчивость применяемых штаммов бактерий к хлориду натрия. Известно, что массовая доля поваренной соли в соленой рыбе составляет от 4 до 13 %, а в мясных продуктах, например колбасах, зависит от вида колбас и составляет до 6 %. В связи с этим на втором этапе исследований изучали влияние хлорида натрия на рост молочнокислых бактерий.

Полученные в результате исследования данные об изменении оптической плотности питательной среды при культивировании представлены на рис. 2 и в таблице. Как показано на рис. 2, увеличение концентрации хлорида натрия в питательной среде сопровождается снижением оптической плотности, что свидетельствует об уменьшении прироста биомассы.

Рис. 2. Динамика изменения оптической плотности питательной среды в процессе культивирования Lactobacillus sakei LSK-103 в присутствии хлорида натрия

Fig. 2. Changes in optical density (OD) of medium during cultivating Lactobacillus sakei LSK-103 in the presence of sodium chloride

Таблица. Выживаемост ь бактерий L a ctobacillus sakei LSK-10 3 в присутст в ии хлорида н атрия Table. Survival of Lactobacill u s sakei LSK-103 in the pr e sence of sod iu m chloride

Характеристи к а	Концен т рация хлор и да натрия, %
	0	2	4	6	8	10
Количество жизнеспособных клеток бакт е рий Lactobacillus sakei LSK-103 ( К ОЕ/см3)	2×10 9	1×109	9×108	6 × 108	3×1 0 8	3×108
Вы ж иваемость бактерий (%)	100	96,8	96,2	9 4,4	91, 2	91,2

Так, например, при ко н центрации х лорида нат р ия, равной 2 %, оптичес к ая плотнос т ь снижается незначительно, а при 8–10 % N aCl наблюд а ется резкое снижение о п тической п л о тности от 1,3 до 0,7, что приводит к замедлению накоп л ения биома с сы. Вместе с тем необхо д имо отмети т ь высокую в ы живаемость клеток Lactobacillus sakei LSK- 1 03, которая н аходится в п ределах 96,8 – 91,2 % в зав и симости от к онцентрации хлорида натрия. При этом о т мечается д о статочно высокая плот н ость попул я ции – 10⁸–10⁹ КОЕ/см³ (см. т аблицу). На способность некоторых шт а ммов бактер и й вида Lact o bacillus sakei развиваться в присутствии высоких концентраций поваренной соли у к азано в работе ( Amadoro et al., 2015 ).

В связи с этим в дальне й ших исслед о ваниях изуч а ли морфоло г ию клеток L a ctobacillus sakei LSK-103 при р азличных концентрация х соли. Данн ы е, представленные на р и с. 3, показ ы вают, что с у величением концентрации соли наблюдает с я агрегация клеток с образованием к л еточных ко н г ломератов, в ключающих преи м ущественно палочковид н ые клетки, а также мультисептирова н ные, ветвящ и еся филаме н ты, которые обеспечивают межклеточное в заимодейст в ие.

0 %

2 %

4 %

6 %

8 %

Рис. 3. Влиян и е различны х концентраций хлорида натрия на мо р фологию бактери й Lactobacillus sakei LSK-103

Fig. 3. Effect of di f ferent concentrations of so d ium chlorid e on m orphology o f bacteria Lactobacillus sa k ei LSK-103

10 %

С увеличением концентрации хлорида натрия интенсифицируются межклеточные контакты с образованием многоклеточных систем, что гарантирует адаптационную физиологическую устойчивость клеток к неблагоприятным факторам среды.

Одна из форм адаптации бактерий к неблагоприятным факторам среды – коллективное взаимодействие, разновидностью которого является когезия, т. е. слипание клеток одного клона или одной ткани ( Олескин, 2009 ). Полученные в данном исследовании результаты подтверждают сведения о том, что присутствие в среде хлорида натрия может приводить к большей агрегации клеток бактерий ( Li et al., 2020; Chowdhury et al., 2007 ).

В дальнейших исследованиях изучали пробиотические свойства Lactobacillus sakei LSK-103. Основные принципы тестирования пробиотической активности разработаны Всемирной организацией здравоохранения, согласно которым пробиотики должны быть устойчивы к воздействию желудочного сока и желчных кислот и выдерживать другие неблагоприятные факторы при прохождении через желудочно-кишечный тракт ( Китаевская, 2012 ). Результаты исследований представлены на рис. 4.

Рис. 4. Влияние желчи, рН и фенола на выживаемость бактерий Lactobacillus sakei LSK-103 Fig. 4. Effect of bile, pH and phenol on survival of Lactobacillus sakei LSK-103

Из анализа представленных на рисунке данных видно, что Lactobacillus sakei LSK-103 характеризуется высокой устойчивостью к желчи и фенолу и растет в широком диапазоне рН, о чем свидетельствуют показатели выживаемости Lactobacillus sakei LSK-103, имитирующие условия желудочно-кишечного тракта. Кроме того, Lactobacillus sakei LSK-103 обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов.

Желчные кислоты в тонком кишечнике выполняют функцию эмульгирования и солюбилизации липидов. Их наличие критическим образом сказывается на микроорганизмах, мембраны которых состоят из липидов и жирных кислот ( Tsuda et al., 2012 ). В результате полученных исследований установлено, что Lactobacillus sakei LSK-103 является устойчивым к содержанию в среде желчи. Выживаемость бактерий составляет 86,02 и 89,25 % при содержании в питательной среде 40 и 20 % желчи соответственно.

Механизмы защиты бактерий от высоких концентраций желчи различны. Например, известно, что штаммы, продуцирующие экзополисахариды, демонстрируют большую устойчивость к желчи и низким значениям рН. Другим механизмом, обеспечивающим защиту бактерий от желчи, является наличие ферментов – гидролаз желчных кислот (Bile salt hydrolase – BSH), которые могут деконъюгировать желчные кислоты, обеспечивая, таким образом, защиту от желчи ( van de Guchte et al., 2002 ).

Низкая кислотность среды также может вызывать молекулярные изменения на поверхности клеток бактерий. Бактерии способны изменять липидный состав своей мембраны в ответ на воздействующие на них стрессовые факторы. Это свойство обеспечивает толерантность бактерий к низкой кислотности среды и неблагоприятным температурам ( van de Guchte et al., 2002 ).

Способность бактерий выживать в щелочной среде также является важным свойством в связи с тем, что значение рН секрета дуоденальных желез варьируется в пределах 5–8 ( Ulleberg et al., 2011 ). При рН 8,3 выживаемость изучаемого штамма составляет 86,02 %. Исследованиями Sawatari и Yokota установлено, что максимальные значения рН, при которых возможен рост молочнокислых бактерий, демонстрируют высокую вариабельность. Эти значения во многом зависят от происхождения штамма ( Sawatari et al., 2007 ).

В процессе пищеварения в кишечнике человека образуются токсичные продукты обмена белков, в том числе фенол, скатол, индол и другие, которые способны вызывать угнетение полезной микрофлоры ( Smith et al., 1997; Китаевская, 2012 ). Лишь устойчивые к фенолу (0,4–0,5 %) штаммы бактерий способны приживаться в желудочно-кишечном тракте. В этой связи при исследовании пробиотических свойств бактерий обычно изучается устойчивость к фенолу ( Somashekaraiah et al., 2019; Китаевская, 2012 ). Данное исследование показало, что Lactobacillus sakei LSK-103 является достаточно устойчивым к фенолу (0,4 %): количество жизнеспособных клеток бактерий составило 10⁷ КОЕ/см³, а выживаемость – 75,27 %.

Полученные в данной работе результаты демонстрируют, что в ответ на изменения окружающей среды, связанные с воздействием повреждающих факторов, микроорганизмы включают эволюционно выработанные и наследственно закрепленные механизмы адаптации, позволяющие популяции пережить неблагоприятные для роста условия.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что Lactobacillus sakei LSK-103 обладает достаточно высокой биохимической активностью и устойчивостью к неблагоприятным для роста условиям.

Полученные результаты демонстрируют гибкое реагирование Lactobacillus sakei LSK-103 на повышение концентрации хлорида натрия в питательной среде.

Отмечена высокая выживаемость Lactobacillus sakei LSK-103 при воздействии факторов, имитирующих условия в желудочно-кишечном тракте, что свидетельствует о его пробиотических свойствах.

Выявленные в настоящей работе закономерности роста Lactobacillus sakei LSK-103 при высоких концентрациях хлорида натрия открывают широкие перспективы для биотехнологической обработки рыбного сырья и создания ферментированных рыбных продуктов.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук (номер гранта МК-128.2020.11).