Изучение чувствительности различных штаммов микобактерий туберкулеза к новым туберкулостатикам

Туберкулез по-прежнему остается серьезной проблемой государства и общества. Каждый день в России в среднем появляется 124 случая этой болезни, от которой 14 человек умирают. В России отмечается высокий уровень распространенности туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью как среди новых случаев (9%), так и при повторном лечении (24,4%). [ 2 ]

Эпидемическая и эпизоотическая ситуации по туберкулезу продолжают оставаться напряженными. Туберкулез крупного рогатого скота занимает особое место среди других инфекционных болезней животных, его своеобразие в том, что болезнь долгие годы может протекать без проявления клинических признаков. В неблагополучных стадах достаточно остаться не выявленным одному больному животному, чтобы на долгие годы продлить проведение оздоровительных мероприятий. [ 3 ]

Одной из причин увеличения заболеваемости туберкулезом и смертности от него является увеличение числа больных с тяжелыми формами заболевания, особенно вызванными лекарственно-устойчивыми микобактериями, что затрудняет проведение эффективного лечения, способствует развитию необратимых хронических форм и обусловливает высокую летальность. Распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и неконтролируемый характер инфекций создают дополнительные проблемы при лечении с помощью традиционных противотуберкулезных препаратов.

Для лечения больных множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза требуется примерно 2 года, для лечения больных, зараженных чувствительными к основным препаратам штаммами микобактерий туберкулеза, - 6-8 месяцев.

Низкая эффективность используемых в настоящее время противотуберкулезных препаратов объясняется длительным (более полувека) их использованием, постоянным ростом количества больных с множественной лекарственной устойчивостью, вызванным появлением лекарственно-резистентных штаммов микобактерий. Большинство лекарственных препаратов действует неселективно, поэтому возникает необходимость ввода избыточного количества лекарственного вещества, что приводит к возникновению серьезных побочных проявлений в виде нарушения функций печени, почек, гемопоэза и т.д.

Новые противотуберкулезные препараты в последние 40 лет не появлялись. Поэтому поиск, создание новых фармацевтических препаратов, обладающих антимикобактериальными свойствами и позволяющих повысить эффект химиотерапии, остается весьма актуальной задачей. [ 1 ]

В связи с вышеизложенным, в Казанском институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова синтезированы новые противотуберкулёзные препараты - «Линарол» и «Линарол -Ф1», которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезных средств в ветеринарной и медицинской практике для профилактики и лечения туберкулеза.

Эффективность любого противотуберкулезного препарата оценивают не только по наличию бактерицидной и бактериостатической активности, но и по способности предотвращать развитие лекарственной устойчивости. Поэтому целью наших исследований было выяснение влияния новых синтезированных препаратов на лекарственную чувствительность различных штаммов микобактерий.

Материал и методика исследований. Чувствительность микобактерий к исследуемым препаратам проводили в сравнительном аспекте по отношению с уже известными и используемыми противотуберкулезными препаратами: изониазидом, рифампицином, офлоксацином,  стрептомицином,  этамбутолом,  этионамидом и их различными сочетаниями.

Лекарственную устойчивость микобактерий к вышеперечисленным препаратам определяли методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна – Йенсена без содержания в ней крахмала согласно приказу МЗ РФ №109 от 21.03.2003.

Линарол разводили согласно прописи изониазида. В питательную среду непосредственно перед свертыванием добавляли рабочие разведения данного вещества. Расчеты производили с учетом процента активности препарата.

Для определения эффективности действия препаратов использовали бактериальные суспензии:

• •     культуры микобактерий туберкулеза штамма H37Rv;

• •     культуры микобактерий туберкулеза штамма M. bovis 14;

• •     культуры    микобактерий    туберкулеза    обладающего

устойчивостью к большинству противотуберкулезных препаратов;

• •     культуры микобактерий выделенного от больного человека;

• •     культуры микобактерий выделенного от инфицированного

крупного рогатого скота.

Выросшие на плотной питательной среде культуры микобактерий снимали лопаточкой и помещали в толстостенную стеклянную пробирку. Тщательно растирали стеклянной палочкой и постепенно добавляли стерильный физиологический раствор. Полученную суспензию переносили в стерильную пробирку. Культуры стандартизировали по оптическому стандарту мутности №5. Разводили в 10 раз стерильным физиологическим раствором. После приготовления суспензий всех взятых приготовленных образцов вносили стерильной пипеткой по 1 мл суспензии микобактерий, соответствующих стандарту №5. Получили суспензию с содержанием клеток соответствующих 5 x 10 микробных тел. Посев на среды производился из этих суспензий. Вносили по 0,2 мл суспензии, в верхнюю 1/3 косяка, во все пробирки, которые культивировали при 37 градусах. Инкубирование проводилось до 4 недель при обязательном еженедельном просмотре.

Результаты определения лекарственной устойчивости учитывали на 21 день после посева. При скудном росте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляли еще на 1-2 недели в термостате до получения выраженного роста в контроле.

Культуру считали чувствительной к данной концентрации препарата, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Культуру считали устойчивой к той концентрации препарата, которая содержится в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20 колоний при обильном росте в контроле.

Результаты исследований. Результаты определения лекарственной устойчивости микобактерий к испытуемым препаратам отражены в таблице 1.

1. Определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к новым туберкулостатикам

Концентрации препаратов	Рост колоний микобактерий туберкулеза
	H37 Rv	M. bovis 14	Устойчивый штамм	Штамм, выделенный от человека	Штамм, выделенн ый от КРС
Изониазид 1 мкг\мл	* -	-	+*	+	-
Изониазид 10 мкг\мл	-	-	+	-	-
Рифампицин 40 мкг/мл	-	-	+	+	-
Рифампицин 80 мкг\мл	-	-	+	+	-
Изониазид (10 мкг\мл) + рифампицин (40 мкг/мл)	-	-	+	-	-
Офлоксацин 10 мкг\мл	-	-	+	-	-
Стрептомицин 10 мкг\мл	-	-	+	+	+
Стрептомицин 25 мкг\мл	-	-	+	+	-
Этамбутол 2 мкг\мл	-	-	+	-	-
Этамбутол 5 мкг\мл	-	-	+	-	-
Этионамид 30 мкг\мл	-	-	+	-	-
Этионамид 50 мкг\мл	-	-	+	-	-
Линарол 10 мкг\мл	-	-	-	-	-
Линарол-Ф1 10 мкг\мл	-	-	-	-	-
Контроль (среда, не содержащая препаратов)	+	+	+	+	+

*Примечание:«-» - отсутствие роста (менее 20 колоний); «+» - наличие роста микобактерий (более 20 колоний).

В результате проведенных исследований установлено, что новые противотуберкулезные препараты – «Линарол» и «Линарол-Ф1» проявили выраженное бактериостатическое действие ко всем исследованным штаммам микобактерий туберкулеза.

Концентрации изониазида, рифампицина, офлоксацина, стрептомицина, этамбутола, этионамида и их различные сочетания вели себя согласно литературным данным: штамм Н37Rv и M. bovis 14 был чувствителен ко всем концентрациям препаратов при положительном контроле, устойчивый штамм микобактерий туберкулеза проявил свою устойчивость ко всем препаратам.

Штамм, выделенный от больного человека, оказался чувствительным к изониазиду в дозе 10 мкг/мл среды, сочетанию изониазида и рифампицина, а также к офлоксацину, этамбутолу и этионамиду в различных концентрациях.

Штамм, выделенный от инфицированного крупного рогатого скота, оказался не чувствительным лишь к стрептомицину в концентрации 10 мгк\мл среды. К изониазиду в концентрации 1 и 10 мкг\мл среды, а также к остальным исследуемым препаратам в различных концентрациях этот штамм оказался чувствительным.

В контроле, к 21 дню исследования, отмечался обильный рост микобактерий туберкулеза всех исследуемых штаммов.

Выводы и предложения. Таким образом, проведенное исследование показало, что новые туберкулостатики «Линарол» и «Линарол-Ф1» обладают выраженным бактериостатическим действием на культуральные и лекарственно устойчивые штаммы микобактерий.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Визель А.А. Лечение туберкулеза органов дыхания / А.А. Визель // Казань: КГМУ МЗ РФ – ГП ВЭО «Саламат», 1998. – 121 с. 2. Гулюкин М.И. Оздоровительные мероприятия при туберкулезе крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, А.Х. Найманов, В.А. Ведерников, Н.Г. Толстенко, Н.К. Букова, Н.А. и др. // Журнал «Ветеринария», 2012. - №1. – С. 3 – 8. 3. Овдиенко Н.П. Туберкулез как международная и национальная медико-ветеринарная проблема в современных условиях / Н.П. Овдиенко, Н.Г. Толстенко, Н.А. Яременко, П.П. Рахманин, Н.В. Мельник и др. // Научно-производственный журнал «Ветеринарный врач», 2009. - №2. – С. 14 – 17.

ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА К НОВЫМ ТУБЕРКУЛОСТАТИКАМ

Мингалеев Д.Н., Честнова Р.В., Хамзин Р.А., Садыков Н.И.

Резюме

Изучена чувствительность различных штаммов микобактерий туберкулеза к новым туберкулостатикам «Линаролу» и «Линаролу-Ф1». В результате проведенных исследований установили, что новые туберкулостатики обладают выраженным бактериостатическим действием в отношении лекарственно устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза.

THE STUDY OF SENSITIVITY DIFFERENT CULTURES MYСOBAKTERIUM TUBERCULOSIS OF NEW TUBERKULOSTATICS

Mingaleev D.N., Chestnova R.V., Hamzin R.A., Sadykov N.I.