Изучение фенольных соединений кожуры (перидермы) картофеля обыкновенного с целью получения лекарственной формы, обладающей антимикробной активностью

источников получения этих веществ. Особый интерес представляют отходы промышленного производства, в том числе пищевой промышленности. В процессе переработки наиболее распространённого продукта питания – картофеля образуется от 20 до 50% отходов, основная часть которых приходится на кожуру (перидерму) [5]. В то же время исследования, проведённые за рубежом, показали, что водные и водно-спиртовые извлечения из кожуры клубней некоторых сортов картофеля содержат значительное количество фенольных соединений [6] и обладают антиоксидантной [5, 7, 8] и антидепрессивной [9] видами активности.

Цель работы: исследование фенольных соединений кожуры картофеля, разработка технологии получения лекарственной формы и определение ее антимикробной активности.

Материалы и методы. Сырье заготавливали от картофеля сорта «Невский», выращенного на территории Краснодарского края. Сырьё собирали осенью 2013 года.

Предварительную оценку растительного материала на наличие в нём фенольных соединений проводили методами одно- и двумерной хроматографии на бумаге (ТХ) и тонкослойной (ТХ) на силикагеле. Использовали хроматографическую бумагу марки «Ленинградская С» и пластины «Сорбфил» (ПТСХ-П-А-УФ», производитель ЗАО «Сорбполимер», размером 10Ч10 и 10Ч15). Хроматограммы развивали в восходящем и нисходящем токах растворителей. В качестве элюирующих систем применяли:

для БХ: уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (10 : 2 : 3); н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 2) и (4 : 1 : 5); 15% и 30% уксусная кислота [3];

для ТХ: хлороформ; хлороформ - петролей-ный эфир (1 : 2); хлороформ - этанол (9 : 1) и (9 : 3); хлороформ - этанол - вода (10 : 2 : 0,1); толуол - этилацетат - уксусная кислота (5 : 4: 1) [2].

Отдельные порции (по 10 г) высушенного до постоянной массы и измельчённого растительного сырья (кожура светло жёлтого цвета толщиной не более 1 мм) трёхкратно экстрагировали 96%, 70%, 40% спиртом этиловым и водой. Экстракцию проводили в колбе с обратным холодильником. Время каждой экстракции - 60 минут. Полученные извлечения упаривали в выпарительной чашке до 3 мл. Для хроматографирования брали 0,02-0,05 мл экстракта. После разделения веществ хроматограммы просматривали в видимом и УФ-свете, затем обрабатывали парами аммиака, 5% спиртовым раствором алюминия хлорида; 10% спиртовым раствором калия гидроксида, свежеприготовленным диазореактивом - диазотированной сульфаниловой кислотой, 2% спиртовым раствором железа хлорида (III), 1% раствором ванилина в хлористоводородной кислоте.

На основании испытаний, проведенных методами БХ и ТСХ, был сделан вывод, что наибольшее число пятен на хроматограммах, принадлежащих фенольным соединениям, содержатся в извлечении, полученном экстракцией сырья 40% спиртом этанолом. Поведение веществ на хроматограммах, цвет зон адсорбции, наблюдаемый в видимом и УФ-свете до и после обработки детектирующими реактивами позволило отнести эти вещества к флавонам, катехинам, фенолокислотам, кумаринам [2,3].

Подтверждение качественного состава фенольных соединений проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для исследования использовали хроматограф фирмы “GILSTON” (модель 305, Франция); инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA. Компьютерную обработку результатов осуществляли с помощью программы Мультихром для Windows. Неподвижной фазой являлась металлическая колонка размером 4,6х250 мм KROMASIL C18 ,размер частиц 5 микрон, подвижной фазой -система метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная, в соотношении (400:600:5). Анализ проводили при комнатной температуре в течение 60 минут. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора “GILSTON” UV/VIS модель 151 при длине волны 254 нм.

Рис. 1. Хроматограма водно-спиртового извлечения из кожуры клубней картофеля сорта «Невский»

Для подготовки пробы 10 г сырья экстрагировали 40% этанолом вышеописанным способом. Извлечение выпаривали досуха в выпарительной чашке на водяной бане и сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре не превышающей 600С. Навеску экстракта (0,9272 г) помещали в колбу вместимостью 100

мл, прибавляли 20 мл 70% спирта этилового и нагревали в течение 1 часа с момента закипания растворителя на кипящей водяной бане. Смесь охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 25 мл и доводили 70% спиртом этиловым до метки. Параллельно в 70% спирте этиловом готовили серию 0,05% растворов сравнения следующих веществ: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, кемпферола, гиперозида, геспередина, апигенина, нарингенина, дигидрокверцетина, катехина, эпикатехина; эпигалокатехингаллата (ЭГКгал-лат), танина; кумарина, дикумарина, а также кислот: галловой, кофейной, хлорогеновой, неохлорогеновой, коричной, цикориевой, феруловой. По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали в выше приведенных условиях. Вещества идентифицировали путём сопоставлением времени удерживания компонентов исследуемого раствора и растворов сравнения. Результаты исследования извлечения полученного экстракцией сырья спиртом этиловым 40% метода ВЭЖХ представлены на рисунке (рис. 1) и в табл. 1.

Таблица 1. Результаты исследования фенольных веществ кожуры клубней картофеля сорта «Невский» методом ВЭЖХ

Наименование РСО	Время удер-жива-ния, мин	Количественное соотношение в смеси,% от суммы
о-кумаровая кислота	3.112	6.57
танин	3.289	6.51
галловая кислота	3.548	13.73
ЭГКгаллат	4.297	9.62
хлорогеновая кислота	4.972	4.83
эпикатехин	5.536	5.15
цикориевая кислота	6.951	3.60
неохлорогеновая кислота	7.504	2.84
дигидрокверцетин	9.56	1.76
феруловая кислота	10.68	23.24
кумарин	12.66	9.55
лютеолин-7-глюкозид	13.83	3.49
гиперозид	15.76	0.60
неидентифицировано	8.339	4.04
неидентифицировано	14.94	2.26
неидентифицировано	19.65	2.21

Таким образом, методом ВЭЖХ в 40%-ном извлечении из кожуры клубней исследуемого сорта картофеля было зафиксировано шестнадцать пиков, тринадцать из которых принадлежат веществам фенольной природы. Прежде всего, это фенолокислоты. Доля этих веществ в сумме всех фенольных соединений составляет 54,81%. Основными фенолокислотами являются феруловая и галловая. В извлечении также обнаружены флавоноиды. На долю лютеолин-7-глюкозида, гиперозида, дигидрокверцетина приходится только 5,85%. Несколько больше содержится катехинов – 14,77%. В изучаемом извлечении кроме выше перечисленных соединений идентифицированы танин и кумарин. Все вещества в исследуемом объекте установлены впервые, однако полученная закономерность о соотношении фенольных соединений соответствует данным, полученным для кожуры клубней других сортов картофеля [6].

Так как ранее проведенными исследованиями [4] установлено, что извлечение из кожуры картофеля обладает антимикробной активностью, авторами была поставлена задача – разработать на его основе 40% спиртового извлечения мазь косметического направления и изучить её антимикробную активность. Сырьё экстрагировали спиртом этиловым 40% методом перколяции. Спиртовую вытяжку очищали отстаиванием при пониженной температуре, затем сушили в вакууме при температуре, не превышающей 600С до получения густого экстракта [1]. В качестве мазевых основ использовали следующие вспомогательные компоненты: классическая мазевая основа вазелин с ланолином в равных соотношениях, карбопол-940 и олеогель (масло подсолнечное, аэросил). При проведении предварительных биофармацевтических исследований in vitro с помощью диффузии в 3% желатиновый гель (реактив: трехвалентное железо) установили, что максимальное высвобождение обеспечивает основа олеогель, которая сама по себе обладает противоожоговым действием (рис.2).

Рис. 2. Результаты биофармацевтических исследований высвобождаемости мазей

С учетом приведенных на рис.2 результатов были приготовлены две 5% мази на разных основах. Кроме действующего вещества в состав первой входили глицерин, аэросил, масло подсолнечное, экстракт чёрного ореха в качестве консерванта и пропиленгликоль (как пенетрант), в состав второй прописи - те же компоненты, но без экстракта чёрного ореха. Микробиологические исследования разработанных мазевых композиций определяли методом диффузии в агар (способ «колодцев») по отношению к 11 тест-культурам. Вводили по 0,1 г мази. Оценку результатов проводили путем измерения диаметра зон задержки роста вокруг «колодца», включая диаметр самого «колодца». Отсутствие зоны задержки роста свидетельствует о том, что испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации препарата; диаметр зоны задержки роста на 10 мм показывает на умеренную чувствительность культуры к данной концентрации препарата, а диаметр зоны задержки роста более 10 мм на высокую чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации препарата. В качестве объектов сравнения использовали мази, полученные на основе 40% жидких экстрактов из цветков арники и бессмертника, которые сгущали до консистенции густых экстрактов. Результаты определения антимикробной активности исследуемых образцов представлены в табл. 2.

Таблица 2. Антимикробная активность исследуемых мазей

Объекты исследования (компоненты мази)	Диаметр зоны задержки роста тест-культур микроорганизмов, мм
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
40% экстракт из кожуры картофеля, глицерин, аэросил, масло подсолнечное, экстракт чёрного ореха, пропиленгликоль	21	23	15	23	-	-	22	-	13	-	24
40% экстракт из кожуры картофеля, глицерин, аэросил, масло подсолнечное, пропиленгликоль	12	13	-	11	12	-	20	11	13	-	23
40% экстракт из арники, глицерин, аэросил, масло подсолнечное, пропи-ленгликоль, эмульгатор цестопал	-	10	-	11	13		18	12	-	13	22
40% экстракт из бессмертника, глицерин, аэросил, масло подсолнечное, пропиленгли-коль, эмульгатор цесто-пал	-	-	-	16	-	-	20	-	11	-	20

Примечание: используемые тест-культуры: 1. Staphylococcus aureus (209); 2. Staphylococcus aureus (Макаров) ; 3. Staphylococcus aureus (Type) ; 4. Staphylococcus epidermidis Wood-46 ; 5. Escherichia coli 675 ; 6. Salmonella galenarum ; 7. Bacillus subtilis L 2 ; 8. Bacillus anthracoides – 1 ; 9. Bacillus anthracoides - 96 ; 10. Pseudomonas aeruginosa ; 11. Proteus vulgaris

Из приведенных в табл. 2 данных следует, что мази, полученные на основе экстрактов из кожуры картофеля, обладают выраженной антимикробной активностью. По величине эта активность не уступает образцам сравнения по отношению к Staphylococcus epidermidis Wood-46 ; Bacillus subtilis L 2 ; Bacillus anthracoides - 96; Proteus vulgaris , и превосходит их по отношению к Staphylococcus aureus (209); Staphylococcus aureus (Макаров) и Staphylococcus aureus (Type). При введении в состав мази экстракта грецкого ореха её антимикробная активность по отношению к ряду тест-культур усиливается.

Выводы:

• 1.    В результате проведенных исследований методами бумажной и тонкослойной хроматографии установлено, что извлечение из кожуры (перидермы) клубней картофеля сорта

• 2.    Методом ВЭЖХ идентифицированы 6 фе-нолокислот, 5 веществ флавоноидной природы относящихся к флаванонолам, катехинам, гликозидам флавонов и флавонолов, одно вещество, относящееся к кумаринам и танин. Содержание фенолокислот составило 54,81%, флавоноидов 5,85%, танина 14,77%.

• 3.    На основе 40% спиртового извлечения разработана технология получения лекарственной формы - 5% мази на различных мазевых основах, показавшая выраженную микробиологическую активность, которая в ряде случаев усиливается при добавлении в её состав экстракта из грецкого ореха.

• 4.    Результаты исследований подтверждают   5.

  Schieber, A. Potato Peels: A Source of Nutritionally and Pharmacologically Interesting Compounds – A Review/ A. Schieber, M.A. Saldaňa // Food Global Science Books. 2009. P. 23-29.

  Lewis, C.E. Anthocyanins and Related Compounds in Potatoes (Solanum tuberosum L.): A thesis submitted of Doctor of Philosophy in Biochemistry University of Canterbury Christchurch, New Zealand, 1996. 367 p.

  Ezekiel, R. Beneficial phytochemicals in potato — a review / N. Singh, S. Sharma, A. Kaur // Food Research International. 2013. V.50. P. 487-496.

  Ah-Hen, K. Antioxidant capacity and total phenolic compounds of twelve selected potato landrace clones grown in Southernchile / K. Ah-Hen, C. Fuenzalida, S. Hess et al. // Chilean journal of agricultural research. 2012. V. 72 (1). P. 3-9.

  Keerthi, V. Evaluation of antidepressant activity of ethanolic and aqueous extract of Solanum tuberosum peel / V. Keerthi, M. Sriramoju, D. Alumdri, S. Akula // J. Compr. Phar. 2014. V. 1 №5. P. 164-167

  
  

«Невский», полученное экстракцией 40% спиртом этиловым, содержит разнообразный комплекс фенольных соединений.

перспективность дальнейшего изучения отходов клубней картофеля с целью создания на их основе биологически активных субстанций и лекарственных форм.                                  .